论文部分内容阅读
目的:蛋白质巯基亚硝基化修饰(S-亚硝基化),指一氧化氮(NO)及其衍生物修饰蛋白质半胱氨酸(Cys)巯基-SH,生成-SNO,是一种典型的氧化还原依赖的蛋白质翻译后修饰方式。目前,蛋白质亚硝基化是蛋白质修饰研究的热点之一。研究了海人藻酸受体(KA受体)GluR5亚基的S-亚硝基化的生物化学分子机制和可能的信号转导机制,进一步探究了GluR5亚基S-亚硝基化可能的功能。
方法:分别给予Sprague-Dawley大鼠侧脑室注射KA受体GluR5亚基的高选择性激动剂ATPA(0.6ug/10μl)、GluR5亚基拮抗剂NS3763(3nmol/5μl)、IP3R拮抗剂2-APB(5nmol/5μl)、磷脂酶C(PLC)抑制剂U73122(2nmol/5μl)、胞内钙离子清除剂BAPTA-AM(10nmol/5ul)、内质网Ca2+-ATP酶选择性抑制剂Thapsigargin(5umol/5ul)、腹腔注射L型钙通道拮抗剂Nifidipine(20mg/kg)、腹腔注射nNOS抑制剂7-NI(25mg/kg)。采用四动脉结扎法构建大鼠全脑缺血模型,脑室注射PSD95反义寡核苷酸(10nmol/10μl)。
运用SDS-PAGE、免疫印迹、免疫沉淀等方法对蛋白质的亚硝基化以及蛋白质之间的相互作用进行研究;应用焦油紫染色的方法检测ATPA诱导的以及脑缺血/复灌诱导的海马神经元的存活和死亡;蛋白质的S-亚硝基化的检测通过‘生物素转化法(Biotin-Swich method)。
结果:
1.KA受体GluR5亚基的高选择性激动剂ATPA可以诱导GluR5亚基的S-亚硝基化,GluR5亚基拮抗剂NS3763,磷脂酶C(PLC)抑制剂U73122,IP3R拮抗剂2-APB和nNOS抑制剂7-NI均能抑制ATPA引起的GluR5亚基的S-亚硝基化,胞内钙离子清除剂BAPTA-AM部分抑制ATPA引起的GluR5亚基的S-亚硝基化作用,内质网Ca2+-ATP酶选择性抑制剂Thapsigin增加了ATPA引起的GluR5亚基的S-亚硝基化。
2.PSD95、nNOS、GluR5三者之间能形成信号模块,脑缺血/再灌注能促进GluR5与nNOS结合,而注射PSD95反义寡核苷酸后能显著降低三者之间的结合水平。
3.焦油紫染色结果说明,单独脑室注射ATPA,并不能引起神经细胞死亡,而ATPA对脑缺血/复灌诱导的海马神经元损伤有保护作用。
结论:ATPA引起的GluR5亚基的S-亚硝基化,可能是通过G蛋白、PLC、IP3R信号通路介导的胞内Ca2+浓度升高引起的,该S-亚硝基化作用由nNOS催化产生的NO介导,并可能与GluR5-PSD95·nNOS信号模块有关;ATPA通过激活GluR5,引起GluR5亚基的巯基亚硝基化,该S-亚硝基化作用对神经细胞损伤可能有保护作用。