论文部分内容阅读
体细胞克隆技术在再生医学、动物育种和濒危动物保护方面有重要的应用前景。该技术的应用也推动了发育生物学的快速发展，增强了我们对细胞命运决定机理的认识。体细胞克隆技术在多个大家畜、实验动物和少数几个野生动物上获得了成功。根据供受体细胞来源，体细胞克隆技术分为同种克隆和异种克隆。藏羚羊（Pantholops hodgsonii）隶属偶蹄目（A rtiodactyla）牛科（Bovidae）藏羚属（Pantholops），属中国国家I级保护动物，系青藏高原特有种，也是青藏高原动物区系的典型代表种和生态系统的重要指示物种。上个世纪，由于疯狂盗猎和极端气候事件，藏羚羊种群急剧下降，研发藏羚羊保护的有效和潜在策略成为重大的科技需求。然而，对于珍稀野生动物，由于数量稀少，获得雌性藏羚羊卵母细胞进行同种克隆的可能性很小，而异种克隆就成为一种可尝试的途径。 藏羚羊的分子系统发育分析表明，藏羚羊与绵羊和山羊的亲缘关系最近，经估算藏羚羊与绵羊山羊的分化时间大约为220万年前。因此，利用容易获取的绵羊卵母细胞进行藏羚羊-绵羊异种克隆。然而，实验室前期工作发现，藏羚羊-绵羊、藏羚羊-山羊和藏羚羊-牛重构胚体外发育阻断，极难发育到囊胚。基于前期基础，本研究提出的关键科学问题是:藏羚羊-绵羊异种体细胞核移植的重构胚胎发育阻断在哪个阶段，发育阻断是否由胚胎基因组激活(embryonic genome activation，EGA)异常而导致？ 为解答以上科学问题，本实验利用显微操作系统，以藏羚羊耳部成纤维细胞作为核供体，以绵羊卵母细胞为受体胞质进行核移植获得异种克隆胚胎，观察重构胚的体外发育情况，利用单细胞转录组测序技术对实验样本进行转录组测序分析，关注克隆胚胎在发育过程中基因表达的动态变化，挖掘调控早期胚胎发育的分子机制，探究异种克隆胚胎发生早期发育阻滞的可能原因。同时，为优化卵母细胞培养系统，为重构胚的构建提供优质卵母细胞，本研究探讨了卵母细胞成熟优化方案。本论文的研究主要得到了以下结论: 1.在体外培养条件下，绵羊-绵羊同种克隆胚和藏羚羊-绵羊异种克隆胚的卵裂率分别约为93％和90％;绵羊-绵羊同种克隆胚可发育至囊胚，囊胚率为12.7％，而藏羚羊-绵羊异种克隆胚只能发育至桑椹胚，桑椹胚率为16.0％。 2.体外发育的异种体细胞核移植(iSCNT)重构胚胎存在着发育的阻断。由体细胞核移植重构胚早期发育率系统评估的数据可以看出，38.2％的藏羚羊-绵羊异种重构胚阻断在4～8-细胞期，与此相比，阻断在此时期的绵羊-绵羊同种重构胚的比例为28.6％。可以推测异种重构胚胎致密化存在问题。 3.由于异种克隆胚胎阻断发生在8-细胞期，推测可能存在基因组激活异常。因此选择同种克隆和异种克隆胚胎进行转录组测序。转录组测序数据显示，异种克隆胚与同种克隆胚相比，我们共获得了483个显著差异表达的基因，其中显著上调表达的基因的有102个，显著下调表达的基因381个。 4.转录组数据分析表明，很多显著差异表达基因都与胚胎发育过程中的重要生物功能相关，如CDCA8、CDC20、TAMM41、NLRP5、TUBA1b、HSF1等，以及与mRNA降解、细胞骨架与粘附蛋白等重要通路相关的基因。这与胚胎基因组激活的异常而导致体细胞重编程异常、重构胚胎不能正常发育的假设符合。 5.优化绵羊卵母细胞体外成熟培养系统的研究得出，C-X-C趋化因子12(C-X-C motif chemokine12，CXCL12)可以显著提高绵羊卵母细胞质量，提高其发育率及存活率。瞬时抑制CXCR4可抑制卵母细胞核成熟，然而补充重组CXCL12显著增加了经历中期Ⅰ(MⅠ)的卵母细胞的比例。 总之，异种体细胞核移植重构胚胎存在核质相容性不匹配、胚胎基因组激活过程不能完全完成、胚胎致密化和囊胚形成缺陷等问题。基因的表达异常导致重构胚胎线粒体DNA与核基因组之间不能正常互作，体细胞不能完成重编程的过程，胚胎桑椹胚阶段内细胞团和滋养层细胞不能正常发生分离而进一步形成囊胚。各种因素综合，导致了异种克隆胚胎发育的异常和停滞。由于转录组数据量比较庞大，后期应再加强对数据的充分分析利用，进行一些深度个性化的分析。