【摘 要】
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突触结合蛋白（synaptotagmin, SYT）家族是一个多功能跨膜蛋白家族,主要存在于神经和内分泌系统的囊泡中。迄今已在哺乳动物中发现并鉴定了17种SYT家族的亚型,已知其中的7种亚型能通过它们的C2结构域与Ca2+结合。我们解析了结合有Ca2+和醋酸根离子的人SYT5C2A结构域的晶体结构。醋酸根离子的结合位点可能模拟了SYT5C2A结构域与磷脂磷酸基的结合位点。我们对SYT5C2A结构域
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突触结合蛋白（synaptotagmin, SYT）家族是一个多功能跨膜蛋白家族,主要存在于神经和内分泌系统的囊泡中。迄今已在哺乳动物中发现并鉴定了17种SYT家族的亚型,已知其中的7种亚型能通过它们的C2结构域与Ca2+结合。我们解析了结合有Ca2+和醋酸根离子的人SYT5C2A结构域的晶体结构。醋酸根离子的结合位点可能模拟了SYT5C2A结构域与磷脂磷酸基的结合位点。我们对SYT5C2A结构域的Ca2+结合口袋与其它SYT进行比较,分析了引起Ca2+结合口袋构象变化的关键残基。我们推测Ca2+结合口袋的开闭程度可能会影响与磷脂双分子层解离时SYT与磷脂荷电头部间的静电排斥势能。SYT5C2A结构域与其它SYT的C2结构域的折叠模式相似,而其Ca2+结合口袋的开闭程度在具有Ca2+结合能力的SYT中居中,这与先前所测的SYT5的胞质部分与磷脂脂质体复合物依赖Ca2+的解离速率常数在具有Ca2+结合能力的SYT中居中这一实验结果一致。我们推断Ca2+结合口袋的构象变化可能是拥有高度的序列与整体结构相似性的SYT能以不同的Ca2+响应速率调节多种膜泡融合过程的一个重要原因。甘露糖酸脱水酶（Mannonate dehydratase, ManD; EC4.2.1.8）催化一分子D-甘露糖酸脱去一分子水生成2-酮-3-脱氧-D-葡萄糖酸。该酶存在于多种细菌和古细菌中,催化Entner-Doudoroff途径中D-葡糖醛酸分解过程的第三步反应。序列比对结果表明Gram阴性菌的ManD比Gram阳性菌的ManD多了一段插入序列。为阐明该插入序列对酶的催化效率的影响,我们解析了大肠杆菌K12菌株的ManD及其与底物复合物的晶体结构。结果显示,此插入序列形成2段位于催化活性位点上方的α螺旋。这两个插入的α螺旋导致与它们相连的一个loop覆盖于底物结合口袋之上,这使得底物进入与产物离开催化活性位点的通道受限。定点突变及酶活实验证实酶的催化速率因此loop而降低。这些特征在Gram阴性菌中是保守的,因此,与Gram阳性菌相比,Gram阴性菌的ManD中的这段插入序列能够导致酶的催化速率下降,从而降低葡糖醛酸的代谢速率。除此以外,我们还通过分析底物结合残基并配合突变酶活实验鉴定了几个底物进入催化活性位点所必需的残基。在酿酒酵母中,TRM6与TRM61组成了一个tRNA甲基转移酶。该酶催化tRNA尤其是起始密码子tRNA的58位腺嘌呤的1位N原子的甲基化（m1A58）。TRM61是结合甲基供体——硫腺苷甲硫氨酸的亚基,而两个亚基都为结合底物tRNA所必需。我们表达并纯化了TRM6-TRM61复合物,并获得了其晶体,收集了一套分辨率为2.80A的衍射数据。为阐明TRM6-TRM61的催化机制以及这两个亚基间的相互作用方式奠定了基础。在细菌和真核生物中,嘌呤从头合成的最后两步由一个双功能嘌呤生物合成蛋白（PurH）所催化。该酶由两个以柔性区域相连的功能独立的结构域组成。其中,N端结构域具有次黄嘌呤核苷酸单磷酸环水解酶的活性,而C端结构域具有5-氨基咪唑-4-氨甲酰核苷酸甲酰基转移酶的活性。与真核生物和古细菌的PurH相比,细菌的PurH有许多插入和缺失序列,这些序列差异可能导致细菌的PurH的结构域间的相对取向与其他物种的不同。我们表达并纯化了大肠杆菌K12菌株的PurH （EcPurH）,并获得了其晶体,收集了一套分辨率为3.05A的衍射数据。这为探究细菌PurH的两个催化结构域间的相对取向对催化效率的影响奠定了基础。
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