雉科鹌鹑(Coturnix coturnix)免疫功能基因Cathelicidin的克隆、原核表达及功能分析

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Cathelicidin是在哺乳动物体内发现的一类具有多功能的抗微生物肽家族,因在信号肽与成熟肽之间含有一段高度保守的cathelin而自成一个家族。目前在许多物种中都发现了cathelicidin,并且越来越多的cathelicidin正在被发现。研究发现抗菌肽不仅能够直接抑制和杀灭病源微生物,同时具有多种免疫调节活性,在宿主的天然和适应性免疫中起着重要的作用,因而具有广阔的应用前景。此外,cathelicidin还具有抑制组织损伤,促进创伤修复,结合内毒素,诱导血管生成等多种生物学功能。在本论文中,我们以鹌鹑(Coturnix coturnix)为例,对鸡形目雉科鸟类进行了物种自身免疫系统中重要的免疫基因,cathelicidin(Cc-CATHs)的基因克隆,序列分析,原核表达及蛋白功能与结构分析。并对尤其是鸡形目物种该基因家族的起源以及结构多样性和功能分化的进化机制进行了初步探讨。我们构建了鹌鹑脾cDNA文库,用半巢式PCR的方法,从cDNA文库中克隆得到三种cathelicidin家族抗微生物肽,并命名为Cc-CATH1、Cc-CATH2和Cc-CATH3。cDNA序列长度分别为545bp、530bp和555bp,由此推断出它们前体氨基酸序列,其中包括信号肽区、保守的cathelin区和成熟肽区三部分。并预测了它们的成熟肽:Cc-CATH1的成熟肽序列(26个氨基酸残基),RVKRVLPLVIRTVIAGYNLYRAIKRK;Cc-CATH2的成熟肽序列(32个氨基酸残基),LVQRGRFGRFLKKVRRFIPKVIIAAQIGSRFG和Cc-CATH3的成熟肽序列(29个氨基酸残基):RVRRFWPLVPVAINTVAAGINLYKAIRRK。进化分析表明,鹌鹑cathelicidins与已发现的环颈雉cathelicidins和原鸡cathelicidins有很高的同源性,说明它们在进化过程中有很近的亲缘关系。并且我们可以以鹌鹑cathelicidins为标签,判断其它物种与鹌鹑以及其它物种之间的亲缘关系的远近。化学合成的Cc-CATH2和Cc-CATH3对检测的40余种菌具有广谱的杀菌活性,尤其是一些临床分离的耐药性菌株。研究还检测了Cc-CATHs对细胞的毒性和对人血红细胞的溶血活性,结果显示Cc-CATHs对细胞表现极其微弱的毒性和溶血活性。此外,重组体Cc-CATH2成功的在大肠杆菌中表达,并纯化得到具有活性的多肽。在临床耐药菌问题日益严重的今天,鹌鹑cathelicidins的发现为抗菌药物的开发提供了良好的模板。
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