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卵泡闭锁的生理实质就是激活颗粒细胞与卵母细胞的凋亡。相关研究认为,体外条件下获得的不同发育潜能的未成熟卵母细胞可能来源于处于不同闭锁程度的卵泡,而发生闭锁卵泡中的卵母细胞在体内条件下是注定要走向凋亡的。所以,探讨卵泡内细胞凋亡与卵母细胞发育潜能的相关性,已成为相关研究的一个热点。本研究通过建立不同发育潜力卵母细胞的形态标准,采用多种凋亡检测手段,检测牛卵丘-卵母细胞复合体中卵丘细胞与卵母细胞凋亡情况及其与卵母细胞发育潜能的相关性;同时在体外成熟系统中添加外源FasL以诱发卵母细胞凋亡,探讨Fas信号通路对卵母细胞凋亡的调控作用,进一步深入了解牛卵母细胞凋亡与其发育潜能之间的相关性。一、不同发育能力未成熟COCs形态标准的建立根据卵胞质均匀程度和卵丘细胞状态,将卵丘细胞完整包被的COCs分为:Ⅰ组(具有5层以上卵丘细胞且卵胞质颗粒化);Ⅱ组(具有5层以上卵丘细胞且卵胞质均匀);Ⅲ组(具有2-5层卵丘细胞且卵胞质颗粒化);Ⅳ组(具有2-5层卵丘细胞且卵胞质均匀)。在此基础上,利用地衣红染色与体外受精技术,检查四类COCs中卵母细胞在体外成熟22小时后的核成熟情况与受精后的发育能力差异,以建立不同发育能力未成熟COCs形态标准。结果显示,四组卵母细胞核成熟率为:71.8%、57.8%、84.2%、69.2%;卵裂率、囊胚发育率和孵化囊胚率分别为66.4%、22.7%和5.9%;57.5%、15.7%和3.9%;85.0%、38.9%和15.9%;75.0%、26.4%和8.6%。结果表明,Ⅰ组和Ⅲ组卵母细胞核成熟率、卵裂率、囊胚发育率和孵化囊胚率均分别高于Ⅱ组和Ⅳ组。其中,Ⅲ组卵母细胞的上述各项指标明显高于Ⅱ组(P＜0.05)。由于颗粒化卵胞质与轻度扩散卵丘细胞等形态特征被认为是早期闭锁发生的一种信号,所以本研究所建立的不同形态标准COCs的发育能力差异可能与其卵泡所处不同早期闭锁状态相关。二、不同发育能力COCs中卵丘细胞凋亡检测Annexin-V染色结果显示,各组卵丘细胞中早期凋亡细胞占大多数(65.85%-83.20%)。Ⅲ组卵丘细胞中早期凋亡细胞比率显著高于其他三组(P＜0.05)。Ⅰ组早期凋亡细胞比率也明显高于Ⅱ组(P＜0.05)。TUNEL检测结果显示,各组卵丘细胞中晚期凋亡细胞比率较低(0.78%-6.35%)。其中,Ⅲ组卵丘细胞中晚期凋亡细胞比率显著高于其他三组(P＜0.05)。Ⅰ组中晚期凋亡细胞比率也略高于Ⅱ组(P＞0.05)。结果表明,卵母细胞发育能力较高的Ⅰ组与Ⅲ组中卵丘细胞也表现较高的凋亡水平,进一步验证Ⅰ组与Ⅲ组COCs可能采自具有较强早期闭锁信号的卵泡。三、不同发育能力COCs中卵母细胞凋亡检测1、四组COCs中卵母细胞TUNEL检测在各组COCs中均未观察到TUNEL阳性卵母细胞。所以本研究中四组未成熟卵母细胞的发育能力差异应该与晚期凋亡无关。2、Bax和Bcl-2蛋白定位表达检测免疫荧光检测结果显示,Bax蛋白主要定位于胞浆与细胞核附近;Bcl-2蛋白主要定位于细胞核及其附近区域。3、四组COCs中卵母细胞Annexin-V与实时定量RT-PCR检测四组卵母细胞的Annexin-V阳性率分别为28.6%、14.7%、46.4%和26.1%。其中,Ⅲ组卵母细胞Annexin-V阳性率显著高于其他三组(P＜0.05);Ⅱ组Annexin-V阳性率最低;实时定量RT-PCR检测结果显示,Ⅲ组卵母细胞中Bax相对表达量显著高于Ⅱ组(P＜0.05)。Ⅰ组和Ⅲ组中Bax的相对表达量要分别高于Ⅱ组和Ⅳ组。结果表明未成熟卵母细胞中早期凋亡程度与其发育能力呈正相关。四、FasL对卵母细胞凋亡与胚胎发育的影响1、Fas和FasL蛋白定位表达检测免疫荧光染色结果显示,Fas蛋白在未成熟卵母细胞中有表达,而未检测到FasL蛋白。Fas蛋白主要定位于卵母细胞膜上、核附近以及胞浆中个别区域。2、FasL对体外成熟卵母细胞凋亡的影响成熟培养液中添加不同浓度的FasL,观察其对成熟后卵母细胞早期和晚期凋亡的影响。Annexin-V染色结果显示,2、10、50ng组中Annexin-V阳性卵母细胞率(55.3%,51.2%,62.4%)显著高于对照(0ng)组(13.6%)(P＜0.05)。TUNEL结果显示,对照(0ng)组中未发现TUNEL阳性卵母细胞;2、10、50ng处理组中观察到不同比例的阳性细胞(20.8%,41.6%,48.4%)。其中,各处理组晚期凋亡阳性率显著高于对照组;10ng、50ng组显著高于2ng处理组(P＜0.05)。数据显示,FasL促进了成熟后卵母细胞凋亡的发生,且凋亡诱导因子的浓度与凋亡细胞率呈正相关。3、FasL对卵母细胞体外成熟和发育的影响核成熟结果显示,添加2ng组中卵母细胞达MⅡ期比率(67.9%)明显高于0ng组(45.6%)(P＜0.05)。极体排出率统计结果显示,2ng组极体率(83.0%)显著高于对照组(63.2%);10ng与50ng组极体率(53.7%和50.0%)低于对照组。囊胚率统计数据显示,2ng组(22.0%)和对照(0ng)组(21.8%)囊胚率没有差异,10ng(11.5%)与50ng(6.4%)组囊胚率显著低于对照组和2ng组(P＜0.05)。结果说明,FasL诱导的卵母细胞重度凋亡明显造成卵母细胞成熟与受精后胚胎发育能力的降低,但是轻度凋亡的2ng组卵母细胞的成熟与发育能力似乎并没有受到影响。本研究系统探讨了卵泡闭锁、卵丘细胞和卵母细胞凋亡与卵母细胞发育能力的相关性,首次提出未成熟卵母细胞可能处与“凋亡临界点”之前早期凋亡阶段理论,并就早期凋亡对卵母细胞发育能力的影响进行研究。同时利用细胞自身分泌蛋白实现了对卵母细胞凋亡的人工诱导,初步探讨了调控卵母细胞凋亡的相关机制。本研究从凋亡角度解释了体外胚胎生产效率低下的原因,这一尝试对于促进体外受精和转基因动物等相关技术的发展与应用有着重要的理论与实践意义。