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目的:OPRK1与OPRM1受体属于阿片受体家族,在神经系统中的分布广泛,其与AD疾病密切相关,课题前期研究提示基因甲基化与AD疾病的关联性,本研究将继续探索其在AD的早期阶段即轻度认知障碍(MCI)中的DNA甲基化改变。此外,利用高通量芯片检测方法识别新的疾病风险甲基化基因,为后续的研究提供新的依据。方法:在新疆地区的流行病学调查研究得到的5398例样本中,按照年龄、性别、民族匹配的原则随机抽取MCI和对照各96例,利用磁珠法进行基因组DNA的提取,亚硫酸氢盐转化后利用焦磷酸测序方法定量检测OPRK1、OPRM1基因的甲基化水平,并且应用双荧光素酶报告系统进行启动子活性检测。此外,来自宁波市康宁医院6对性别年龄匹配的AD与对照样本,利用450K芯片进行全基因的甲基化水平测定。结果:第一部分:病例对照组比较分析结果:维族和汉族中OPRK1基因甲基化与MCI没有关联(p>0.05),性别分层结果显示OPRK1基因高甲基化与汉族女性MCI患病相关(p=0.015);OPRM1基因,CpG1位点高甲基化与维族MCI患病相关(总体p=5.16E-05,男性p=0.015,女性p=1.20E-03),CpG2-4低甲基化与汉族MCI患病相关(总体p=0.002,男性p=0.018,女性p=4.98E-02)。不同民族间的甲基化比较结果:两个民族中基本资料存在差异,应用logistic回归对其进行校正,OPRK1甲基化在MCI与对照族中均没有民族差异(p>0.05),OPRM1基因中CpG1位点甲基化在病例组中存在民族差异(CpG1 p=0.002,adjust p=0.009)CpG2-4位点甲基化在对照组中存在民族差异(CpG2-4 p=0.005,adjust p=0.009)。此外,结合前期的研究,将不同地域(新疆和浙江)汉族对照人群的基因甲基化结果进行比较,OPRK1甲基化在总体及男性分组中存在地域差异,而在女性中没有地域差异(总体p=0.006,男性p=2.31E-04,女性p>0.05),OPRM1基因在新疆汉族人群中甲基化水平显著高于浙江汉族人群中甲基化水平(CpG1总体p=2.99E-05,男性p=0.006,女性p=0.001;CpG2-4总体p=1.32E-13,男性p=1.71E-08,女性p=2.74E-05)。偏相关分析(控制组别、性别、BMI、血糖、甘油三酯、胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇因素)显示维族中OPRM1 CpG2-4甲基化与年龄存在正相关关系(r=0.220,p=0.039)。双荧光素酶实验结果进一步提示,相较于阴性对照pGL3-Basic,OPRK1与OPRM1重组质粒均能促进下游萤火虫荧光素酶的表达,OPRK1使表达水平增加2.248倍(p=0.008),OPRM1增加2.616倍(p=0.003)。第二部分:应用450K检测6对样本之间的甲基化水平差异,AD与对照组间甘油三酯水平差异有统计学意义(p=0.025),后续的差异分析中利用线性模型对其进行校正,以|delta beta|>0.2且p<0.05为标准,共得到41个差异甲基化位点对应于33个基因,其中18个位点高甲基化,23个位点低甲基化。结论:OPRK1高甲基化为汉族女性MCI的风险因素,并且该片段具有启动子活性,可能存在低表达水平,环境因素对于汉族男性OPRK1甲基化存在影响,对汉族女性没有影响。OPRM1特定位点甲基化与不同民族的MCI风险相关,CpG1位点高甲基化是维族MCI患病的风险因素,CpG2-4位点低甲基化是汉族MCI患病的风险因素。此外,CpG1位点甲基化在MCI中存在民族差异,而CpG2-4位点甲基化在对照中存在民族差异。环境因素能够影响OPRM1甲基化水平,表现为新疆汉族OPRM1甲基化水平高于浙江汉族;年龄是MCI重要的危险因素,维族人群中OPRM1 CpG2-4基因甲基化水平随年龄增长而增长,OPRM1检测片段具有启动子活性。高通量芯片研究为后续提供新的研究依据,其中近启动子区域的差异甲基化位点的应在扩大样本中进行验证,尤其应对MCI到AD的进展过程中甲基化如何改变进行研究。