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随着人类基因组计划的完成、功能基因研究的深入,基因诊断已成为分子生物学和生物医学的重要研究领域。DNA生物传感器作为一种利用核酸碱基配对原则进行识别,能对基因片段实现持续、快速、灵敏和选择性检测的新方法,近年来发展非常迅速。MicroRNA (miRNA)作为一种内源性小分子RNA,广泛存在于人体和几乎所有模式生物的细胞中,在细胞的增殖、发育、生长分化、凋亡、代谢及癌变等一系列生命过程中起着重要的调控作用。miRNA的分析检测是其生物功能研究、疾病诊断以及相关基因药物开发的关键技术,近年来也取得了长足的发展。本文致力于核酸新方法的研究,发展了一系列核酸分析新方法。1.基于多酶功能化碳纳米球及石墨烯-纳米金杂化材料的双重信号放大策略构建超灵敏DNA电化学传感器以多酶标记的碳纳米球做信号分子,结合石墨烯-纳米金杂化材料修饰电极,进行双重信号放大,构建超灵敏DNA电化学传感器。电化学还原后得到的石墨烯(ERGO),通过强的π-π堆积吸附上DNA单链d(GT)29SH, d(GT)29SH以Au-S键形式结合上修饰了探针DNA的金纳米颗粒(AuNPs-ssDNA),形成石墨烯／DNA/纳米金(ERGO-AuNPs)杂化材料。非共价组装的方式,避免破坏各个组分的结构和性质。该工作制备的金属一碳杂化材料有非常好的导电性,修饰电极时能有效增加电子转移效率。另外,合成了大小均匀(120 nm左右),分散性良好碳纳米球。以碳纳米微球(CNS)作为载体,富集上大量的辣根过氧化物酶(HRP),制备超灵敏纳米检测信标,使得检测时,每次杂交就能引入多个HRP,产生非常强的信号。所提出的多酶功能化碳纳米球及ERGO-AuNPs杂化材料为基础的双重信号放大策略,使构建的DNA传感器具有宽的检测范围(10-13-10-17M)和低的检测限(0.8×10-7M)。同时改传感器,还具有良好的区别单碱基错配能力和重复性。该工作所构建的DNA检测方法,简单、灵敏,在生物分析检测中具有潜在应用前景。2.量子点功能化聚合微球的制备、表征及在DNA传感器中的应用利用去乳化的方法合成大小均一(323 nm),分散性良好的聚丙烯一苯烯酸微球,在微球表面层层组装PAH/PSS/PAH高分子膜后(331 rim),通过静电作用富集大量CdTe量子点(9.54×10。个),制备量子点功能化的聚合微球。量子点独特的物化性质,使制备的功能化微球可以作为理想信号放大载体,用于构建电化学和光学生物传感器。该工作以CdTe量子点功能化的聚合微球为放大平台构建DNA电化学传感器,通过方波伏安法(SWV)检测酸溶解CdTe所释放的Cd2+,进而检测DNA的杂交。构建的DNA电化学传感器基于微球为基础的量子点的富集及电化学本身对Cd2+的富集的双重信号放大作用,具有宽的线性范围(10-11-10-15M)、低的检测限(0.52 fM)和高的选择性。此外,利用荧光倒置显微镜可发展DNA光学检测的方法。所提出的功能化微球制备的方法扩展到不同的微球和量子点,以制备多种具有独特电化学性质和光学性质及生物特征的功能化微球,在生物分析中具有广阔的应用前景。3.基于量子点与氧化石墨烯能量转移机制构建生物分子检测平台基于量子点(QDs)和氧化石墨烯(GO)荧光共振能量转移(FRET)体系发展生物分子的新型检测平台。在这个体系中,修饰了分子信标(MB)的QDs作为探针用于识别目标分子,由于MB和GO间强的结合作用,QDs的荧光被GO所淬灭。当MB结合目标分子时,QDs与GO的距离增加,结合了目标分子的MB与GO的作用也降低,致使QDs与GO的FRET被抑制,QDs的荧光增强,通过荧光强度的变化实现对目标生物分子进行检测。这种GO引起的荧光淬灭的方法用于DNA的检测有很多优势,比如避免对MB进行荧光基团的修饰；具有高的淬灭效率、灵敏度、以及好的选择性。如将其它DNA探针如适体修饰QDs,可发展检测其它生物分子的检测平台。本文以适体和蛋白质为模型,研究了其它生物分子的FRET检测体系。该工作首次将QDs和GO的FRET引入生物分子的检测,为灵敏检测生物分析的方法的发展开辟了新的途径。4.新型聚乙烯亚胺-石墨带纳米载体用于锁核酸修饰分子信标的运输及胞内microRNA识别发展新型聚乙烯亚胺包裹石墨烯纳米带(PEI-g-GNR)复合纳米材料,构建有效的基因载体。通过对多壁碳纳米管(MWCNTs)纵向剖开制备GNR。GNR在强酸中超声后,其表面功能化上羧基,通过静电作用是新PEI GNR表面在组装,制得PEI-g-GNR复合纳米材料。实验发现PEI-g-GNR能够保护锁核酸修饰的分子信标(LNA-m-MB)探针免于核酸酶和单链结合蛋白(SSB)的干扰。另外,由于GNR大的比表面积,其表面容易结合大量高密度的PEI,与PEI或PEI-g-MWCNTs相比,PEI-g-GNR具有更高的转染效率。在优化转染的条件,PEI-g-GNR的毒性及引起的细胞凋亡作用可以忽略。LNA对miRNA具有很高的结合能力及特异性,当LNA-m-MB结合PEI-g-GNR形成LNA-m-MB/PEI-g-GNR复合物进行细胞转染时,能够原位地识别胞内的miRNA.以海拉细胞(HeLa)为模型,对单细胞内miRNA的检测进行了研究。结果表明PEI-g-GNR是一种非常有前景的非病毒载体,可以作为基因载体在临床中原位检测细胞质中的基因。5.功能化Sn02纳米颗粒用于特异性细胞识别、细胞成像及microRNA的定量检测构建新型叶酸(FA)功能化的具有荧光特征的Sn02纳米颗粒,通过在纳米颗粒上结合不同的基因探针,实现对富含叶酸受体(FR)肿瘤细胞的特异性识别、转染、示踪及对胞内miRNA的抑制和检测。在Sn02纳米颗粒表面修饰上胺基化的聚乙二醇磷脂,制备具有良好水溶性的表面带有胺基活性基团的Sn02。表面的伯胺进一步连上FA,或通过交联剂引入巯基。FA功能化的Sn02以双硫键形式结合上不同的基因探针后,能够特异性地识别富含FR的肿瘤细胞并进行高效的转染。转染进胞内的纳米颗粒,能利用自身的荧光进行示踪。同时,双硫键在胞内断裂,连接的探针被有效释放出来,抑制miRNA的表达或对miRNA进行定量检测。核酸酶实验及干扰蛋白实验表明功能化的纳米颗粒(f-SnO2)能有效地减少探针的降解从而减少假阳性信号的产生。同时细胞毒性和凋亡实验证明,f-SnO2具有非常好的生物相容性。此f-SnO2纳米复合材料具有特异性细胞识别、基因载体、胞内示踪及miRNA抑制或检测等多种功能,在生物医学和临床中具有广阔的应用前景。