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目的:α-葡萄糖苷酶(α-glucosidase,EC 3.2.1.20),根据功能也称α-D-葡萄糖苷水解酶和葡萄糖苷转移酶。α-葡萄糖苷酶是一个分子量为62KD的单体酶,它是酶制剂中很重要的品种。它能水解麦芽糖和麦芽低聚糖分子结构中α-1,4-糖苷键,并能将游离出来的一个葡萄糖残基转移到另一个葡萄糖分子或麦芽糖、异麦芽三糖、异麦芽四糖、潘糖等分子上。研究表明人体对淀粉,糊精,蔗糖等碳水化合物的利用和吸收都与小肠刷状缘上的α-葡萄糖苷酶有关,他们在被淀粉酶水解后,进一步被α-葡萄糖苷酶水解。
α-葡萄糖苷酶在低聚异麦芽糖的工业化生产和啤酒糖化工艺中都有广泛应用,但发酵过程中的高温高压对酶活影响很大,因此近年来,来自嗜温和嗜热微生物的热稳定α-葡萄糖苷酶的基本性质和及其工业应用倍受关注。但由于野生菌产α-葡萄糖苷酶能力低,且培养条件苛刻,我们的主要研究方向则集中于采用基因工程方法构建重组菌,通过表达来获得相应的酶。本课题亦采用此方法,在大肠杆菌中克隆并表达嗜热α-葡萄糖苷酶基因。
本研究中,我们以Thermus thermophilus HB27(TT HB27)基因组为模板,扩增了α-葡萄糖苷酶基因(1587bp),并以pET28a(+)质粒作为表达载体在工程菌Escherichia coli BL21(DE3)中表达了全酶(528个氨基酸)。根据其热稳定性高的特点,采用了高温水浴和凝胶过滤层析的方法进行纯化,并对其酶动力学特性进行了研究。确定此酶的反应最适条件以及动力学参数,在理论和应用方面对α-葡萄糖苷酶的了解进行了扩展。
试验方法: PCR法扩增α-葡萄糖苷酶基因,并生工测序；采用传统分子克隆手段TA-cloning构建原核表达系统；采用高温水浴和凝胶过滤层析的方法进行纯化,SDS-PAGE鉴定。BCA法测定蛋白质浓度。根据酶活定义,37℃水浴测定酶活。设定一系列温度梯度与pH梯度,以及通过正交法测定最适反应条件。根据米氏方程计算Km和Kcat。
结果:所克隆的α-葡萄糖苷酶基因核苷酸序列与报道序列的相似性为100％。经过两步纯化,可得到纯度大于95％的α-葡萄糖苷酶。测定的最适温度和最适pH值分别为90℃和pH 6.8;根据酶促反应动力学方程,pH6.8时,37℃和90℃的米氏常数Km分别为0.30mmol/L和0.22mmol/L,催化常数Kcat分别为34.64s-1和226.80 s-1。
结论:本研究成功地构建了α-葡萄糖苷酶基因重组体及其高效原核表达系统。与预期设想相同,嗜热性α-葡萄糖苷酶具有很高的热稳定性,并在高温中性pH值的条件下具有最高活性。
酶学性质抗菌肽(AMPs)是昆虫,植物以及脊椎动物产生的,天然的免疫系统元素。近年来的发展发现,因为分支很多,所以很难通过器官和结构来将这些多肽分类。Drosomycin是果蝇Drosophila melanogaster的体液中免疫产生的抗真菌防御素,它是第一种重组诱导表达的抗菌肽。它共有44个氨基酸,包含8个半胱氨酸,构成4个二硫键:Cys1±Cys8,Cys2±Cys5,Cys3±Cys6 and Cys4±Cys7,碳端残基决定了这个小肽高度致密的结构。Drosomycin具有抗真菌活性,而对酵母和细菌无效,并且有一定的药用价值,如对血清溶菌酶的影响,以及对肿瘤细胞的细胞膜具有破坏作用。本文对它的稳定性进行研究,从而肯定它在农药,医药方面的实际应用前景。
目的:通过实验研究温度,pH值以及变性剂对Drosomycin(DRS)结构和抗菌性的影响。
方法:在温度稳定性方面,设计不同梯度的温度20-90℃,将Drosomycin温浴30分钟,后用荧光光谱和圆二色谱检测蛋白质结构的变化；pH值设定为2.0-10.0,37℃下共浴30分钟,之后荧光分光光度计检测；变性剂采用尿素和盐酸胍分别2M-8M和2M-6M的浓度梯度共浴30分钟,之后进行与温度相同的检测方法。
结果: Drosomyein能在20-50℃,pH4.0-8.0以及在尿素浓度小于5.5M和盐酸胍浓度小于3.5M时,保持结构稳定性。