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蜂王浆是由青年工蜂的咽下腺和上颚腺等腺体分泌的,专供蜜蜂小幼虫和蜂王食用的特殊浆状物质,略带甜、酸、辛辣味。许多研究表明,蜂王浆是一种非常适合人类的天然保健食品,具有抗菌消炎,抗肿瘤,降血压,促进组织生长等功能。近年来,对蜂王浆的研究主要集中在抗肿瘤,抗癌,增强免疫力等方面,而对伤口愈合方面的研究较少。实际上,早在古代,蜂王浆就被用于治疗各类皮肤损伤。因此本课题旨在提取分离蜂王浆的蛋白质组分,建立体外伤口模型,评价蜂王浆及其蛋白质组分促进伤口愈合的作用,比较不同蛋白质组分的功能差异,在细胞水平上初步探究其促进伤口愈合的机制,为蜂王浆在皮肤损伤方面的临床应用提供理论依据,为伤口愈合的治疗提供新线索。主要研究内容和结果如下:(1)蜂王浆对人角质形成细胞生长的影响:实验选用了人成纤维细胞(CCC-ESF-1)和人永生化角质形成细胞(HaCaT)为实验细胞株。当使用蜂王浆培养CCC-ESF-1细胞时,发现在试验浓度范围内,CCC-ESF-1细胞对蜂王浆的作用不敏感,与阴性对照组相比无显著差异,因此不再使用该细胞进行后续研究。在用蜂王浆培养HaCaT细胞之后,发现蜂王浆对该细胞有一定的促进作用,且在48h和72h的有效浓度为3.9 μg/mL与7.8 μg/mL,但高浓度的蜂王浆对该细胞的生长有抑制作用。随后,使用体外伤口模型对蜂王浆促进细胞迁移的效果进行评价,结果显示,蜂王浆在256 μg/mL时显著提高了伤口愈合率,伤口的愈合率为42.60%,阴性对照组伤口愈合率为35.11%;(2)蜂王浆中蛋白质组分的分离提取:参考现有文献,我们将蜂王浆通过超高速离心法,经过三次超高速离心,分离出较为单一的MRJP1。此外,我们还将蜂王浆用水充分溶解后低速离心,收取上清液,用1kDa的透析袋进行三天透析,提取蜂王浆中的水溶性蛋白组分,真空冷冻干燥后用柱层析法对水溶性蛋白质组分进行分离,使用AKTATM pure蛋白质分离纯化系统与superdex 75的凝胶柱进行实验,经过分离条件的不断优化,最佳的提取分离条件为:流速0.7 mL/min,上样量1mg,洗脱液超纯水,可以从蜂王浆水溶性蛋白中分离纯化出两个主要蛋白质组分,标为收集峰1与收集峰2。峰1出峰时间为8-10 min,峰2出峰时间为17-19min。经过SDS-PAGE胶的初步鉴定,收集峰1主要是分子量为55 kDa的MRJP1,收集峰2是分子量约50 kDa和60 kDa的两种混合蛋白质组分。(3)蜂王浆蛋白组分对人角质细胞生长的影响:分离纯化的MRJP1对HaCaT细胞进行MTT比色法实验发现MRJP1对HaCaT细胞的生长无促进作用,使用蛋白纯化系统收集的峰1组分时显示相似结果。但是,当使用收集峰2蛋白组分进行实验时,发现收集峰2对HaCaT有较好的促进效果,24h和48h的有效浓度为0.8 μg/mL与1.6 μg/mL。根据上述实验结果,我们进一步探索收集峰2中的蛋白质组分对体外伤口愈合模型的作用。采用culture insert插件,用HaCaT细胞划痕模型,用收集峰2蛋白质组分作用于划痕处。结果显示,收集峰2蛋白质组分在1.6 μg/mL浓度时极显著的促进了伤口的愈合率,愈合率为52.94%,而阴性对照组的伤口愈合率只有38.76%,说明收集峰2的蛋白质组分对于伤口愈合有一定的促进作用。(4)蜂王浆蛋白质组分促进人角质细胞生长的作用机制研究:最后,我们从细胞周期方面对蛋白质组分促进人角质细胞生长的作用机制进行了初步的研究。进行细胞周期的实验组为收集峰2蛋白质组分的有效浓度,即0.8 μg/mL与1.6 μg/mL。从细胞所处的各个周期的比率上看,收集峰2蛋白对细胞周期并没有影响,说明它促进细胞生长的机制与细胞周期无关,还需要从其他方面进行研究。实验还对收集峰2的混合蛋白质组分进行了定量蛋白质测序,测序结果表明,收集峰2 中的蛋白质主要为 MRJP2(60%),MRJP3(30%),MRJP7(20%)和 MRJP1(1%)。