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目的： RPS20是从临床慢性浅表性胃炎脾虚患者基因差异表达谱研究中发现的主要下调基因之一。本论文在前期IEC-6细胞RNAi的基础上，进一步在CT26结肠癌细胞开展RPS20干扰研究。采用miRNA构建RNAi干扰表达载体，在小鼠结肠癌细胞上筛选高效的miRNA干扰序列并观察RPS20干扰后细胞增殖能力的变化，为后续采用慢病毒包装的方法进行小鼠体内RPS20干扰提供基础。 方法： 1．miRNA体外筛选细胞株确定：从ATCC购买小鼠结肠癌（CT26）细胞株，并对其培养条件、生长特性进行相关的摸索鉴定，在本实验室条件下能够稳定生长传代。细胞计数法测定其生长曲线，观察其对数生长期。对于正常生长状况下的细胞，采用RT-PCR的方法，对RPS20 mRNA进行检测，确定其能够表达。 2．miRNA质粒干扰载体构建及质粒提取鉴定：设计合成4对oligo，退火形成双链，然后用载体构建试剂盒BLOCK-iT Pol II miR RNAi Expression Vector Kit with EmGFP进行重组克隆，将4对双链的miRNA oligo分别插入到miRNA表达载体pcDNA 6.2-GW/EmGFPmiR中，构建4个miRNA表达质粒，并转化至感受态细胞DH5a。LB平板划线，挑选阳性克隆测序。碱裂解法中量提取质粒，限制性内切酶进行单酶切鉴定。 3．脂质体介导法优化CT26细胞转染条件：将阴性对照质粒pcDNA6.2-GW/EmGFP转染CT26细胞，采用荧光显微镜和流式细胞仪探讨脂质体转染小鼠CT26细胞的最佳细胞融合度、转染试剂剂量及质粒 DNA剂量，评价质粒 DNA的转染效率与表达水平，优化脂质体的转染条件。 4．miRNA干扰序列筛选：采用实时荧光定量PCR法检测干扰后48h RPS20 mRNA的表达；Western-Blot检测干扰后48h CT26细胞RPS20蛋白的表达；根据干扰后荧光定量PCR、Western-Blot的结果，筛选出一对效率较高的miRNA干扰序列。采用MTT法及氚3标记胸腺嘧啶核苷（3-H-TdR）检测RNAi后24h、48h、72h细胞增殖能力的改变,并在裸鼠模型上进行RPS20的生理功能鉴定。 5．慢病毒干扰载体构建：将pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR3质粒载体线性化，经过BP重组反应，构建pENTE质粒载体；经过LR重组反应，将pENTE质粒载体与慢病毒目标载体pLenti6.3/V5-DEST连接，构建RPS20 pLenti6.3-EmGFP-miR慢病毒目标载体。采用293FT细胞初步进行病毒包装实验。 结果： 1．RT-PCR检测CT26细胞RPS20mRNA的表达，条带完整、清楚，确定其适合于miRNA干扰序列体外筛选细胞株。CT26细胞在种植后第3天进入对数生长期，在第7~8天达到峰值，之后进入平台期，实验也将在细胞处于对数生长期间进行。 2．miRNA载体质粒构建后，挑取阳性克隆测序，测序结果提示重组克隆中插入片段序列与设计的oligo序列完全一致，测序图谱上没有套峰出现，说明重组载体构建成功。碱裂解法中量提取质粒，经BamHI及SacI酶切为线性质粒，电泳结果提示条带清楚，大小正确，无明显杂带。 3．荧光显微镜下结果提示，细胞融合60%时转染效率最高，并且可以保证细胞生长状态良好。在此条件下，脂质体固定在10.0μL时，质粒4.0μg与质粒6.0μg转染效率没有差别；质粒固定在4.0μg时，脂质体15.0μL的转染效率明显高于脂质体剂量10.0μL（p<0.05）。流式细胞仪结果也进一步提示，质粒4.0μg+脂质体15.0μL的转染效率明显高于质粒4.0μg+脂质体10.0μL。 4．干扰RPS2048h后，四对miRNA序列均在一定程度地抑制CT26细胞RPS20 mRNA的表达，其中以miRNA3最好，与空白对照组相比，差异具有统计学意义（p<0.05）。干扰后48h，与空白对照组相比，miRNA2及miRNA3蛋白表达有一定程度的降低，但是差异没有统计学意义。 采用MTT法检测细胞增殖时发现，4对miRNA序列均能抑制CT26细胞的增殖，但是实验结果重复性差。3-H-TdR检测干扰后CT26细胞增殖的结果表明，miRNA3在一定程度上能够抑制其增殖。 在miRNA3转染CT26细胞后致瘤裸鼠模型的鉴定结果表明，转染后裸鼠肿瘤增长明显减慢，体积及瘤重下降。电镜结果提示，转染后造模组肿瘤组织出现线粒体肿胀、空泡化，嵴脱落。与对照组相比，干扰组肿瘤组织RPS20蛋白表达水平有一定程度降低。 5．经过BP就LR重组反应，构建miRNA3慢病毒干扰载体，经测序鉴定及blast比对，插入序列完全正确。碱裂解法提取质粒，并初步进行了病毒包装及RPS20小鼠体内干扰预实验。 结论: 构建了4对RPS20 miRNA干扰载体，在CT26结肠癌细胞上筛选出效率较高的干扰序列，用于CT26细胞RPS20干扰。结果表明RPS20干扰后CT26细胞增殖能力和对裸鼠致癌能力受到明显抑制，提示所选序列对CT26细胞RPS20干扰成功。研究工作进而构建了miRNA3慢病毒载体，并提取获得纯度较高的质粒DNA，初步进行了病毒包装及滴度测定。论文研究首次发现RPS20对结肠癌细胞功能的影响，并完成了RPS20体内干扰的技术条件，为后续RPS20小鼠体内干扰打下基础。