论文部分内容阅读
目的 探讨高糖对肝癌细胞株HepG2细胞内质网应激、细胞凋亡的影响及其分子机制,并通过高脂饮食联合链脲佐菌素注射构建2型糖尿病(T2DM)模型大鼠探讨褪黑素和西格列汀对T2DM大鼠肝脏的保护作用。 方法 高糖培养HepG2细胞作为细胞模型：Hoechst 33258染色检测细胞凋亡情况,caspase-3活性检测测定促凋亡蛋白caspase-3的活性,western blot检测凋亡相关蛋白procaspase-9、内质网应激(endoplasmic reticulum stress, ERS)相关蛋白(GRP78、CHOP、PERK)、氧化应激相关蛋白p47phox、MAPKs及ASK1的表达情况。HepG2细胞给予抗氧化剂α-硫辛酸、JNK和p38抑制剂(分别为SP600125、SB203580)2 h后联合40 mM葡萄糖刺激,Hoechst33258染色、western blot、细胞免疫荧光分别检测细胞凋亡、凋亡及ERS相关蛋白(Bcl-2、Grim19、GRP78)、CHOP的表达和定位情况。T2DM大鼠模型：37只SPF级雄性SD大鼠随机分配到正常对照(NC)、高脂对照(HF)、2型糖尿病(T2DM)、胰岛素(INS)、褪黑素(MEL)和西格列汀(SIT)组。高脂饮食联合小剂量STZ(27 mg/kg)注射建立T2DM大鼠模型。成功建模后,INS组皮下注射胰岛素(4U/(kg·d)),MEL、SIT组大鼠分别给予褪黑素(10 mg/(kg·d))、西格列汀(10 mg/(kg·d))灌胃。12周后,取大鼠血及肝脏组织,测定血糖、血脂、胰岛素水平,HE染色观察肝脏形态结构,免疫组化(IHC)及western blot分析凋亡、ERS相关蛋白、褪黑素受体的表达变化。结果高糖诱导的HepG2细胞：高糖刺激48 h后,HepG2细胞凋亡比例、caspase-3活性及procaspase-9裂解均随葡萄糖浓度升高而增加；ERS相关蛋白GRP78表达减少而CHOP、PERK表达均上升,p47phox表达亦上调；ASK1表达、JNK和p38磷酸化水平均增加；α-硫辛酸、SP600125和SB203580均可减少高糖诱导的HepG2细胞凋亡、增加抗凋亡蛋白Bcl-2而抑制促凋亡蛋白Grim 19的表达、抑制CHOP表达和核定位。T2DM大鼠模型：成功构建T2DM大鼠模型,T2DM大鼠空腹血糖(FBG)为(16.91±1.79)mmol/L,胰岛素敏感性指数(lnISI)为-6.60±0.21较NC组明显下降,提示存在胰岛素抵抗(insulin resistance, IR)。HE染色显示HF、T2DM组大鼠肝脏组织均发生了病理改变,T2DM组改变更为严重。IHC显示T2DM组大鼠肝脏活性caspase-3表达明显增加且转移到胞核。Western blot显示HF组和T2DM组大鼠肝组织CHOP表达上升而GRP78表达下降,HF组与T2DM组这两个ERS相关蛋白表达水平亦存在显著差别；但ATF-6a在各组大鼠肝脏表达未见明显差异。抗氧化剂Mel和DPP.-4抑制剂SIT虽然不能明显降低T2DM大鼠血浆TG、Tch、LDL-c水平,Mel也不能降低FBG,但它们能显著减少FINS、增加胰岛素敏感性,且对T2DM大鼠肝脏存在明显的保护作用,改善T2DM大鼠肝脏的病理改变,下调CHOP和caspase-3并上调GRP78的表达。结论高浓度葡萄糖可诱导肝癌细胞株HepG2细胞凋亡,其作用机制可能是经由ERS和氧化应激介导的ASKl-p38/JNK通路活化,调控下游凋亡相关基因的表达；而Mel和SIT通过改善T2DM大鼠IR、减轻肝脏内质网应激和减少细胞凋亡而对T2DM大鼠肝脏具有一定的保护作用。