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乙型或丙型肝炎病毒、酒精中毒、药物损伤、遗传代谢、自身免疫性损伤等各种因素均引起慢性持续的肝脏炎症反应,引发以IV型胶原为主细胞外基质沉积于肝脏内,改变了肝脏的正常组织结构,导致肝纤维化（hepatic fibrosis）形成。若持续进展,进一步发展成肝硬化,表现为肝细胞再生结节的生成及肝内门体的分流,临床上出现消化道出血、腹水、肝性脑病、肝癌等并发症,重者危及生命。静止的肝星状细胞（hepatic stellate cells,HSCs）存在于Disse间隙,含有大量的维生素A,各种损伤因素刺激下或自肝脏分离出来并体外培养后,HSCs被激活,失去脂滴,获得增殖能力,产生大量的（extracellular matrix,ECM）,损伤的肝细胞、浸润的炎性细胞和kuffer细胞等分泌多种细胞因子,刺激HSCs活化。国内外学者的研究表明,转化生长因子β（transforminggrowth factor-β,TGF-β）、血小板源生长因子（platelet-derived growth factor,PDGF）、白介素-l（interleukin-1,IL-1）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor,TNF-α）、γ-干扰素（interfer-γ,INF-γ）等促纤维化作用已经明确,这些因子可活化HSCs。目前普遍的观点认为肝纤维化是可以逆转的,活化的HSCs是ECM的主要来源细胞,消除活化的HSCs是实现肝纤维化的重要环节。近几十年来,肝纤维化发病机制及HSCs活化的机制的研究一直是国内外学者关注的热点。近几年临床和动物实验研究显示,表皮生长因子（epidermal growth factor,EGF）家族在肝纤维化及HSCs活化中的起着一定作用。肝素结合性表皮生长因子（heparin-binding epidermal growth factor-like growth factor,HB-EGF）是EGF家族的成员之一,为新型强力丝裂原。HB-EGF在肺、心脏、骨骼肌等组织均有表达,其在肝脏含量极低,在多种刺激因素作用下其合成增多。HB-EGF与表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor,EGFR/ErbB1）和Erb B4结合,激活下游信号通路,促进细胞增殖,抑制细胞凋亡,促进ECM合成。HB-EGF参与组织损伤的早期修复反应,与多种器官纤维化密切相关。研究发现对胰腺纤维化及心脏纤维化均有促进作用。以前我们研究团队发现,活化的HSCs中HB-EGF及其受体高表达,HB-EGF刺激后HSCs增殖增加,HSCs凋亡减少。这些研究提示HB-EGF有促纤维化作用。与此矛盾的是,四氯化碳（carbon tetrachloride,CCl4）、N-亚硝基二甲胺（N-Nitrosodimethylamine,DMN）诱导HB-EGF基因敲除小鼠肝纤维化加重。可见,HB-EGF在肝纤维化中的作用尚不完全明确。本课题对CCl4和胆总管结扎（common bile ligation,BDL）诱导的HB-EGF转基因小鼠肝纤维化模型进行了研究,同时观察了过表达HB-EGF对原代HSCs增殖、胶原合成和凋亡影响及相关机制。本论文分为以下三部分:第一部分:过表达肝素结合性表皮生长因子对小鼠实验性肝纤维化的影响目的:检测四氯化碳和胆总管结扎诱导HB-BEG转基因小鼠肝纤维化程度,旨在探讨HB-EGF对肝纤维化形成的作用。方法:选择过表达HB-EGF转基因（transgenic,Tg）和同周龄、同性别、同窝、非Tg野生型（wild type,WT）小鼠为研究对象,采用腹腔注射四氯化碳（carbon tetrachloride,CCl4）和胆总管结扎（bile duct ligation,BDL）方法建立2种小鼠肝纤维化模型。CCl4模型分为:WT对照组、Tg对照组、WT模型组、Tg模型组,各组动物于最后1次注射CCl4后48小时麻醉处死留取肝脏标本。BDL模型分为:WT假手术、Tg假手术组、WT模型组、Tg模型组。整个造模过程中,所有小鼠所有小鼠手术后2周取材。采用苏木精-伊红（hematoxylin and eosin,H&E）染色观察小鼠肝脏形态学变化,应用天狼星红染色测定胶原纤维在肝脏内的沉积情况,碱水解法检测肝组织中羟脯氨酸的变化,免疫组织化学染色测定肝组织中HB-EGF、α-SMA蛋白表达变化,Western blot和Real time PCR法测定HB-EGF、α-SMA、I型胶原、TIMP-1、MMP-13蛋白和基因的表达,明胶酶谱法测定MMP-13蛋白。结果:1 Real time PCR、western blot和免疫组化染色结果证实HB-EGF在HB-EGF Tg小鼠肝脏被中被成功过表达。2 H&E及天狼星红染色结果显示HB-EGF增加CCl4和BDL小鼠肝纤维化程度。3过表达HB-EGF促使ECM在肝脏内过度沉积。在CCl4和BDL诱导的肝纤维化模型,HB-EGF Tg模型组天狼星红染色面积明显高于WT模型组。4过表达HB-EGF增加了肝脏羟脯氨酸的含量。在两种肝纤维化模型中,与WT模型组比较,HB-EGF Tg模型组肝组织羟脯氨酸含量明显增加。5 HB-EGF诱导肝脏I型胶原合成增加。Western blot和Real time PCR检测结果显示,两种肝纤维化模型小鼠肝组织I型胶原含量在Tg模型组明显高于WT模型组。6肝纤维化组织中α-SMA的表达:免疫组织化学染色结果可见,CCl4和BDL诱导的模型组织中,α-SMA阳性染色区域主要分布在汇管区及纤维间隔,两种模型小鼠对比,Tg模型组较WT模型组明显增加。Western blot和Real time PCR方法测定肝组织α-SMA蛋白和基因表达变化,结果显示在CCl4和BDL诱导的肝纤维化模型中,WT模型组、Tg模型组均明显高于相应的对照组,Tg模型组较WT模型组增加。7 HB-EGF下调两种肝纤维化小鼠MMP-13/TIMP-1比值。HB-EGF应用Real time PCR检测TIMP-1mRNA、MMP-13mRNA在肝组织中的表达,结果显示两种模型小鼠TIMP-1mRNA的相对表达量均明显高于相应的对照组,Tg模型组较WT模型组明显增加;MMP-13mRNA相对表达量在两组间无改变,两组模型组MMP-13mRNA/TIMP-1mRNA比值明显下降。western blot测定TIMP-1、MMP-13蛋白表达情况,结果验证了HB-EGF加速MMP-13/TIMP-1比值下调。明胶酶谱法结果显示过表达HB-EGF抑制了MMP-13的活性,这进一步证实了上述研究结果。结论:HB-EGF促进CCl4和BDL诱导的肝纤维化形成,这与其下调MMP-13/TIMP-1比值,降低ECM降解有关;另外,这也与其增加小鼠肝脏内α-SMA阳性细胞有关。第二部分:过表达肝素结合性表皮生长因子促进小鼠原代肝星状细胞殖和胶原合成、抑制其凋亡目的:研究过表达肝素结合性表皮生长因子对小鼠原代HSCs增殖、胶原合成和凋亡的影响。方法:采用改良二步胶原酶灌流法对HB-EGF Tg和WT小鼠肝脏进行原位灌注,随后应用30%Percoll进行密度梯度离心,提取原代HSCs,用0.4%台盼蓝染色和倒置荧光显微镜对分离的HSCs进行鉴定、培养和传代。将原代HSCs分为2组:HB-EGFTg HSCs和WTHSCs组。采用免疫细胞化学方法检测细胞内α-SMA表达,Western blot和Real time PCR法测定了B-EGF、α-SMA、I型胶原、TIMP-1、MMP-13蛋白和基因的表达,明胶酶谱法测定MMP-13的活性。EDU掺入测定细胞DNA合成,CCK-8测定细胞活力Annexin V-FITC标记流式细胞术检测HSCs凋亡率,末段脱氧核苷酸转移酶介导的脱氧三磷酸尿苷缺口末段标记（terminal deoxynucleotidy transferrase UTP-nick end labeling,TUNEL）观察HSCs凋亡。结果:1给予消化酶肝脏内灌注,接着应用Percoll作为介质进行梯度离心得到小鼠鼠原代HSC。鉴定结果提示细胞纯度及存活率均大于90%,得率为1.0×1051.3×105。在在倒置荧光显微镜下,新提取的HSC形态为圆形或椭圆形,在波长328nm荧光激发下,发射出蓝绿色光。在塑料培养瓶生长24 h后,大部分贴壁,外形变成扁圆状,继续培养,逐渐伸展,呈现为星形和梭形。免疫细胞化学染色结果显示活化后的HSCS细胞内表现为α-SMA染色阳性。2 HB-EGF促进HSC细胞内纤维化标志物的合成。应用Real time PCR和western blot方法测定了HB-EGFTg HSCs和WTHSCs细胞内HB-EGF、α-SMA和I型胶原蛋白和mRNA的表达,结果显示从转基因小鼠分离的HSCs细胞内HB-EGF高表达;随着HB-EGF的表达增高,与从野生型小鼠分离的HSCs比较,HB-EGFTg HSCs细胞内的纤维化标志物α-SMA、I型胶原明显增加。3 HB-EGFTg HSCs细胞内MMP-13/TIMP-1比值明显下调。Western blot和Real time PCR结果显示TIMP-1蛋白和mRNA水平在HB-EGFTg HSCs细胞内的表达量均明显高于WTHSCs,但是MMP-13表达轻度上调,MMP-13/TIMP-1比值明显下调。明胶酶谱法测定结果显示MMP-13的活性在HB-EGFTg HSCs细胞受到抑制。4.HB-EGF促进HSC细胞增殖。CCK-8法检测结果显示HB-EGFTg HSCs增殖率显著增加,与此结果相一致,EDU掺入法研究数据表明HB-EGFTg HSCs细胞DNA合成增加。5.HB-EGF抑制HSC细胞凋亡。采用TUNEL染色法对TUNEL阳性细胞进行计数,从HB-EGFTg小鼠提取的HSCs凋亡指数明显低于从WT小鼠获得的HSCs。选用Annexin V-FITC/PI对HB-EGFTg HSCs和WTHSCs进行标记,然后在流式细胞仪进行检测,发现过表达HB-EGF明显减少了凋亡细胞数。结论:HB-EGF增强HSCs增殖活性和胶原合成,减少MMP-13/TIMP-1比值。HB-EGF抑制HSCs凋亡。第三部分:过表达肝素结合性表皮生长因子促进小鼠原代肝星状细胞增殖和胶原合成、抑制其凋亡的机制目的:研究过表达HB-EGF对原代HSCs细胞内其下游分子EGFR、ERK的调节作用。方法:HB-EGF Tg和同窝WT小鼠给予腹腔注射CCL4,每间隔2天1次,共12次。采用胶原酶及链霉蛋白酶原位灌注、Percoll梯度离心,得到原代HSCs。将原代HSCs分为4组:WT对照组、Tg对照组、WT CCl4组、Tg CCl4。采用Western blot测定α-SMA、I型胶原、EGFR、ERK、pEGFR、pERK蛋白的变化;Real time PCR法测定α-SMA、I型胶原、EGFR、ERK、pEGFR、pERKmRNA的表达情况。结果:1 HB-EGF增强CCl4诱导的HSCs活化。Western blot分析显示,给与CCl4处理后,从HB-EGF Tg小鼠分离的HSCs,其α-SMA、I型胶原蛋白水平明显高于从WT小鼠分离的HSCs。2 Real time PCR法测定显示,与WT小鼠对比,HB-EGF、α-SMA、I型胶原mRNA水平在来自CCl4诱导的HB-EGF Tg小鼠的HSCs中明显增加。3 HB-EGF上调了MAPK通路的磷酸化。MAPK通路在肝纤维化起关键作用。Western blot分析显示EGFR磷酸化水平在从HB-EGF Tg小鼠分离的HSCs中明显增加,这进一步活化了其下游效应因子ERK。结论:HB-EGF促进EGFR及其下游因子ERK磷酸化,这是可能是其促进HSCs增殖,抑制凋亡的机制之一。