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根瘤菌与豆科植物的共生固氮,在大自然的氮循环中,发挥着至关重要的作用,是促进环境可持续发展的关键因素之一。有效共生起始于植物与根瘤菌的精妙的分子对话,紧接着根毛发生卷曲,形成侵染线,随后侵染线延长,皮层细胞分化为根瘤原基；根瘤原基最后发育形成根瘤,根瘤中所包裹的根瘤菌最终分化为类菌体,开始固氮过程；共生效率的影响因素贯穿整个过程。为了进一步探究共生影响的潜在机制,本实验室王丹选取碱性土壤优势大豆根瘤菌代表菌株S. fredii CCBAU45436,构建了含有17个不同标签、库容为25500个突变体的Tn5标签突变体库。本论文对这个突变体库,进行基于PCR方法的竞争结瘤能力衰弱的突变体筛选。15批初筛后,本研究发现了19个竞争结瘤能力减弱的突变体；结合单接种实验和竞争结瘤验证,最终找到了四个严重影响共生竞争结瘤能力的突变体,它们分别是tatA、pyrC、nrdJ和zur插入缺失突变体；其中,tatA和zur突变体竞争结瘤能力显著降低pyrC突变体只能形成无效畸形根瘤,不能侵染根瘤细胞,没有类菌体形成；nrdJ突变体形成白色球形根瘤,类菌体密度显著降低。随后,构建了突变体的回补菌株,将回补菌株接种于大豆,观察共生表型发现,pyrC和nrdJ突变体的回补菌株表型能够回复到野生型的表型。这些结果表明,单接种没有明显共生缺陷表型的突变株以及在侵染、类菌体分化或者分化稳定性等方面有缺陷的突变株都可能表现出竞争结瘤降低的表型,暗示着竞争结瘤现象可能发生在共生过程的多个阶段。三型分泌系统(T3SS)能够影响多种根瘤菌的共生宿主范围,突变体能够帮助部分与特定宿主不结瘤的菌株恢复结瘤共生的能力。PCR初筛过程中发现,nopA突变体的竞争结瘤能力减弱,而NopA是T3SS的外部结构组分之一。目前,有关大豆根瘤菌的T3SS组分蛋白的研究已经有很多,但是对大豆根瘤菌品种特异性有影响的效应分子还知之甚少。通过与生物信息学研究团队合作,我们对10株大豆根瘤菌(Sinorhizobium fredii, Sinorhizobium soje, Sinorhizobium sp. I和Bradyrhizobium diazofficiens四个种)的T3SS效应分子进行了预测。本研究进一步对 B.diazoefficiens USDA110的5个潜在效应分子进行了实验验证；Q-RT-PCR基因表达检测结果表明,潜在效应分子Bll1636, Bll1877和Bll1804,表达与已知效应分子NopP结果一致,均受到类黄酮的诱导,并且依赖于TtsI转录调节因子；蛋白分泌实验结果表明,这三个效应分子均可以分泌到细胞外,并且分泌过程依赖于T3SS；超敏感响应实验结果表明,这三个效应分子能够转移定位到植物细胞中。因此,这三个效应分子被确定为T3SS效应分子。此外,共生实验表明,Bll1636会抑制S. fredii HH103与G. max Williams 82的共生。与此同时,结合前期获得的9株Sinorhizobium大豆根瘤菌菌株在共生特异性水平上的差异现象,我们筛选了宿主范围窄的菌株中所特有的潜在效应分子,并进行了突变体构建以及共生表型检测。结果发现：原本不能与G. max JD17共生的 S.sojae CCBAU05684在05684GL001675突变后,获得了与JD17共生的能力,而且这个基因的表达也受到了类黄酮的诱导,说明它极可能是一个影响宿主范围的效应分子。这些(潜在)效应分子的获得为进一步研究它们在根瘤菌与不同大豆品种特异性共生互作中的分子机制打下了基础。