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多环芳烃(polycyclic aromatic hydrocarbons,PAHs)是由两个或两个以上的苯环聚合而成的一类化合物,由于具有高的热稳定性和疏水性极极难降解,且具有强的生物毒性,对人类和环境造成非常强的毒害作用。根据报道,环羟化双加氧酶(RHD)为降解多环芳烃的限速酶。本实验室前期筛选到一株红球菌P14,不仅具有油类浮起的特性,还可以高效降解苯并芘、芘和菲等多环芳烃。通过全基因组测序,发现基因组中存在大量参与多环芳烃降解的基因簇。 本文在红球菌P14降解特性和全基因组测序基础上,从基因组中筛选到的预测的RHDs,分析其在三种底物苯并芘、芘和菲诱导下的转录水平;并对在苯并芘和芘表达上调的两组酶进行了系统分类,为之找到了与之同源的电子传递链;以及RHD与之同源的电子传递链的共表达以及重组菌株对多种多环芳烃的降解率分析,初步阐述了多环芳烃的代谢路径途径。主要的研究结果如下: (1)通过全基因组测序,筛选到10组预测的环羟化双加氧酶。选用了三种底物苯并芘、芘和菲,对10组预测的环羟化双加氧酶的在三种底物诱导下的转录水平进行了RT-PCR分析。基因RHD(bidA和bidA2)在苯并芘和芘诱导下特异性表达或表达上调,推测基因bidAB和bidA2B2可能参与多环芳烃的苯并芘和芘的降解。根据bidA和bidA2与相关蛋白质构建的系统进化树,基因bidA与红串红球菌TA421中末端双加氧酶大亚基有中等程度的氨基酸相似度为69％;bidA2与来不动杆菌ADP1环羟双加氧酶大亚基antA有较低的氨基酸相似度(49.6%)。 (2)通过对环羟化双加氧酶进行系统分类,bidA为TypeIVRHO,bidA2为TypeIIRHO。在基因bidAB的上下游找到与之同源的电子传递链[2Fe-2S]-type铁氧化还原蛋白bidC和GR-type铁氧化还原蛋白还原酶(bidD),在bidA2B2的上下游找到了与之同源的电子传递链FNRN-type铁氧化还原蛋白还原酶bidC2。 (3)为了研究RHD(bidABCD和bidA2B2C2)在多环芳烃降解中的作用,将其分别构建共表达载体(pACYCDuet-1和pETDuet-1)转入大肠杆菌中,构建了两株重组菌。重组菌bidABCD对萘的降解率最高达84%,对苯并芘和蒽也有较高效的降解,降解率分别为54%和48.5%,对苯并蒽和芘有较低的降解率分别为37%和19.29%,而初步实验显示对菲、芴和1,1-联苯没有明显的降解。与重组菌bidABCD不同的是,bidA2B2C2对多环芳烃萘和蒽都有非常高的降解率,分别为76.5%和74.4%;对多环芳烃苯并芘和苯并蒽有较高程度地降解,降解率分别为51.5%和56.1%;而初步实验显示对多环芳烃芘、菲、芴和1,1-联苯没有明显的降解。 研究结果为诠释微生物降解多环芳烃的分子机制,高效工程菌的构建及成功应用环境有机污染的生物修复过程奠定了基础。