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古菌其古老的进化地位、奇特的生活习性和与此相关的潜在生物技术开发前景,赋予它迷人的科研价值。研究二硫键异构酶与古菌对环境的适应性和耐受性之间的关系,有利于揭示古菌适应极端环境的分子机理。
本研究用Hungate厌氧操作技术从温泉中分离纯化了1株嗜热产甲烷菌,命名为嗜热自养甲烷杆菌DX0l(Methanothermobacter thermoautotrophicus DX01)。该菌株培养在60℃时呈短杆状,且菌落呈砖红色。分析不同温度生长的细胞全蛋白质图谱,分离得到70℃时表达上调的蛋白质——甲基辅酶M还原酶I。
使用标准菌株嗜热自养甲烷杆菌△HT全基因组序列,筛选了一个预测的ORF——MTH1745,被认为是二硫键异构酶。它含有一个Trx结构域,编码15一个氨基酸。运用实时定量PCR从mRNA水平分析了MTH1745在冷激处理、不同生长温度情况下的表达特征。结果表明,当温度偏离菌体最适生长温度(65℃)或冷激处理(4℃)后,MTH1745 mRNA的表达量会提高,在50℃和70℃时达到最大。表明MTH1745的表达与温度相关,当偏离最适生长温度时MTh1745 mRNA表达上调以帮助体内蛋白质正确折叠。
为了研究MTH1745的功能,成功地构建了E coli(pET-28a-MTH1745)活性检测系统,MTH1745在51℃热胁迫60min能够提高胁迫后细胞的生存率23％。这一结果表明MTH1745对细胞受到热损伤后起到重要的保护作用。
本研究运用分子生物和生物化学技术全面地分析了MTH1745的还原酶,二硫键异构酶和分子伴侣活性。通过胰岛素混浊度实验检测了MTH1745蛋白的还原酶活性,表明MTH1745具有还原酶活性。MTH1745复性还原变性RNase A分析,表明MTH1745具有二硫键异构活性,其活力相当于人PDI的28％。在43℃ MTH1745减少热诱发的柠檬酸合成酶的聚集23％,具有分子伴侣活性。
为进一步确定MTH1745的二硫键异构酶活性,本研究进行了MTH1745对DsbA的互补分析。结果显示菌株JCB573,JCB579,JCB580和JCB581分别回复了AP活性的19.81％,37.98％,26.34％和36.07％,表明MTH1745可部分功能互补大肠杆菌DsbA。
所有分析显示,MTH1745能帮助嗜热自养甲烷杆菌抵抗不适环境的变化,具有二硫键异构酶所共有的酶活特征(还原酶、二硫键异构和分子伴侣活性)。研究嗜热自养甲烷杆菌的二硫键异构酶有助于认识古菌的抗胁迫机制,有助于了解二硫键异构酶的系统发育,为生命的起源和进化提供更多的线索。