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睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonas testosteroni)具有降解许多难降解化合物的能力,在污染物的生物修复上具有很高的应用价值。C.testosteroni具有降解甾核的关键酶3a-羟类固醇脱氢酶/碳酰基还原酶(3a-hydroxysteroid dehydrogenase/carbonyl reductase,3α-HSD/CR)基因,能够以睾丸酮、孕酮和胆汁酸等类固醇类物质为唯一碳源和能源,该菌在这些危害大的稳定化合物的生物修复中起重要作用。然而,涉及这些物质降解的酶在该菌中是诱导表达的。因此,该菌对污染物的消化降解速度很慢,限制了该菌在生物修复中的大规模应用。苏云金芽孢杆菌(Baci llus thuringiensis,Bt)是一种革兰氏阳性产孢细菌,能形成杀虫蛋白、外毒素、几丁质酶和蛋白酶等多种毒素,对多种昆虫以及线虫、螨虫、原生动物都有活性。BtaiiA基因所编码的.AliA蛋白是一种可以降解N-乙酰高丝氨酸内酯(N-acyl-homoserine lactones,AHLs)的内酯酶,从而减弱某些致病菌产生的危害。
本研究将3a-HSD/CR和aiiA这两个基因相连接构建了双基因融合表达载体,纯化并检测了融合蛋白的生物活性。同时也构建了真核表达载体。研究方法和结果如下:
根据GenBank上已公布的3α-HSD/CR(774 bp)全长基因序列,设计一对PCR扩增引物。构建了3α-HSD/CR基因表达载体pET29a-3a-HSD/CR,在大肠杆菌BL21里进行了诱导表达。
根据GenBank上已公布的aiiA(753 bp)全长基因序列,设计一对PCR扩增引物。以质粒pET29a-3a-HSD/CR为载体构建了3α-HSD/CR与aiiA基因完全融合的重组质粒pET29a-3a-HSD/CR-aiiA,经限制性核酸内切酶酶切鉴定、PCR和核酸序列分析后,以IPTG诱导表达3a-HSD/CR-aiiA融合蛋白,用SDS-PAGE进行鉴定。利用Qiagen公司的Ni-NTA Spin Column进行3a-HSD/CR-aiiA融合蛋白的分离纯化。应用酶联免疫吸附实验(EUSA)和高效液相色谱法(HPLC)分别分析了3a-HSD/CR-aiiA融合蛋白表达及其对睾丸酮降解能力。检测融合蛋白对马铃薯软腐病抑制作用。
结果：表明:
扩增出了3α-HSD/CR(774 bp)及aiiA(753 bp)基因,成功构建了重组质粒pET29a-3a-HSD/CR-aiiA,SDS-PAGE分析显示重组质pET29a-3a-HSD/CR-aiiA在原核系统中得到了表达。成功构建了pET29a-3a-HSD/CR-aiiA双基因的原核融合表达载体。通过HPLC试验表明融合蛋白对睾丸酮有很好的降解能力。通过抑菌实验证实融合蛋白对胡萝卜软腐欧文氏杆菌(Erwinia carotovora)引起的马铃薯软腐病有较好的抑制作用。
以pET29a-3a-HSD/CR-aiiA质粒为模板,PCR扩增获得3α-HSD/CR/aii A基因,与真核表达载体pCMBIA1301定向重组,构建pCMBIA1301-3a-HSD/CR-aiiA真核表达载体,经PCR、限制性核酸内切酶酶切鉴定。结果表明成功构建了pCMBIA1301-3a-HSD/CR-aiiA真核表达载体。