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肿瘤干细胞(cancer stem cells,CSCs)是指存在于肿瘤组织中的一小群具有多向分化、自我更新以及无限增殖能力的干细胞样的细胞亚群。CSCs不但表现干细胞的特性,还表现肿瘤细胞的特性。同时,与肿瘤细胞相比,肿瘤干细胞对化疗和放疗高度不敏感,在肿瘤各个进程的演变中发挥重要作用。因此,研究肿瘤干细胞对于改进目前肿瘤的治疗手段具有十分重要的意义,而靶向肿瘤干细胞的治疗新途径将有可能治愈肿瘤。食管癌(esophageal carcinoma, EC)是常见的消化道恶性肿瘤,其发病率和死亡率均高居不下。食管癌根据组织学分型分为鳞状细胞癌、腺癌及未分化癌,其中90%以上属于食管鳞状细胞癌(esophageal squamous cell carcinoma, ESCC)。多项研究表明,CSCs与ESCC的发生密切相关,CSCs的存在可能是导致ESCC治疗失败的主要原因。靶向肿瘤干细胞可能成为食管癌的有效治疗手段,而深入探索调控ESCC肿瘤干细胞的生物学特征及自我更新的分子机制至关重要。Wnt信号转导通路是正常发育过程的关键信号网络,对细胞维持自我更新、分化、增殖、迁徙及凋亡等起重要作用。研究发现,Wnt/β-catenin信号通路的异常活化,在肿瘤恶性进程演变中发挥重要作用,并且能导致细胞重新编程并形成干细胞样亚型,是调控CSC的关键分子途径。Wnt/β-catenin信号通路中负性调控失控也可激活Wnt/β-catenin信号,导致肿瘤的发生。然而,Wnt/β-catenin信号通路的这些负性调节因子如何调控肿瘤在很大程度上是未知的。microRNA(miRNA)是一类高度保守的非编码RNA,在基因组上定位于与肿瘤相关的脆性位点,含21-25个核苷酸,与靶mRNA的3’UTR完全或不完全互补配对,在转录后水平降解mRNA或抑制蛋白翻译,参与个体发育、细胞凋亡、增殖及分化等众多基础生命活动。新近研究发现,miRNAs在调控肿瘤干细胞分化与自我更新等生物学功能中发挥重要作用,可通过影响相应靶基因的表达来调控CSCs的恶性生物学行为。大量研究显示,miRNA的异常表达参与了食管癌的发生、发展及转移过程。新近研究发现,miR-942调控多种肿瘤的发生发展,可能为肿瘤发生发展的重要调控分子。本课题首先应用qPCR检测了miR-942在ESCC组织和ESCC细胞系中的表达,结果提示miR-942与ESCC的发生发展密切相关,功能实验显示miR-942能促进ESCC肿瘤干细胞干性。为了进一步探讨miR-942在ESCC中的作用和分子机制,我们运用生物信息学软件预测sFRP4、GSK3β及TLE1是miR-942下游靶基因,双荧光素酶报告基因证实sFRP4、GSK3β及TLE1的3’UTR端与miR-942有结合活性。进一步运用小干扰RNA敲减抑制内源性miR-942的ESCC细胞中sFRP4,GSK3p和TLE1的蛋白表达,可增强肿瘤球形成能力,显著增强TOP flash/FOP flash的荧光素酶活性。本课题的研究将加深对ESCC发病机制的了解,并为以miR-942为基础的靶向肿瘤干细胞治疗策略提供理论和实验依据。第一部分：miR-942在ESCC组织中的表达及对ESCC细胞生物学行为的影响目的：miRNA的异常表达参与了食管癌的发生、发展及转移过程。miR-942可调控多种肿瘤的发生发展。本部分拟运用qPCR技术检测miR-942在ESCC组织和细胞系中的表达情况,并建立细胞及动物模型研究miR-942对ESCC生物学行为的影响,为进一步研究ESCC可能的发病机理提供科学依据。方法：● qRT-PCR技术检测miR-942在ESCC组织及周围正常组织中的表达,统计分析miR-942表达与病理参数及临床预后的关系；● qRT-PCR技术检测miR-942在12株ESCC细胞系及2株正常细胞系中的表达,并以Eca109, Kyse510细胞系为研究对象,建立miR-942过表达与抑制的细胞模型;● 基于miR-942过表达与抑制的细胞模型,采用MTT细胞增殖实验、肿瘤球形成实验、流式细胞检测等技术研究miR-942对ESCC生物学功能的影响；● 裸鼠成瘤实验体内环境研究miR-942在ESCC中的作用。结果：● miR-942在ESCC组织中的表达明显高于正常组织,其表达与ESCC的临床分期(P<0.001)、TNM分期(T:P=0.005; N:P< 0.001; M:P=0.004)及分化程度(P=0.045)密切相关；且miR-942高表达的患者预后明显差于miR-942低表达的患者(P=0.01),以上实验结果提示miR-942在ESCC的发生发展中发挥重要作用；● MTT增殖实验显示,miR-942过表达与敲减均不影响ESCC细胞系Eca109和Kyse510的细胞增殖能力。然而,上调miR-942,能促进ESCC细胞中肿瘤球的形成,增加CD90+干细胞样细胞亚群的数目,增加干性转录因子ABCG2、KLF4、SOX2、OCT4和Nanog的mRNA表达水平；特异性抑制剂抑制内源性miR-942,能减弱ESCC细胞中肿瘤球的形成,减少CD90+干细胞样细胞亚群的数目,降低干性转录因子ABCG2、KLF4、SOX2、OCT4和Nanog的mRNA表达水平,以上实验结果提示miR-942对ESCC肿瘤干细胞特性的维持发挥重要作用。●过表达miR-942,Eca109细胞在裸鼠体内肿瘤生长速率及肿瘤体积明显高于空白载体对照组；抑制内源性miR-942,Eca109细胞在裸鼠体内瘤生长速率及肿瘤体积明显低于空白对照组。且过表达miR-942,1×102的Eca109细胞即可成瘤：抑制内源性miR-942,1×104的Eca109细胞只有33.3%的成瘤率;两组对照组中,1×103的Eca109细胞均有50%的成瘤率。上述实验结果提示miR-942可能通过影响ESCC肿瘤干细胞特性在裸鼠体内发挥重要作用。结论：miR-942在ESCC的表达水平与临床分期、TNM分期、组织分期及预后明显相关；功能学实验显示,miR-942可促进肿瘤球形成、干性细胞亚群数量及干性转录因子的表达水平；动物实验结果表明miR-942可能通过ESCC肿瘤干细胞特性影响其在裸鼠体内生长情况。以上结果强烈提示,miR-942可能通过ESCC影响肿瘤干细胞干性在ESCC发生发展中发挥重要的作用。第二部分：miR-942活化Wnt/β-catenin通路对食管癌CSC干性的影响目的：Wnt信号转导通路是正常发育过程的关键信号网络,对细胞维持自我更新、分化、增殖、迁徙及凋亡起重要作用。而Wnt/β-catenin信号通路的不恰当激活,参与肿瘤的发生及侵袭转移过程,并且能导致细胞重新编程并形成干细胞样亚型,是调控CSC的关键分子途径。miRNAs通过与靶mRNA的3’UTR完全或不完全互补配对,在转录后水平降解mRNA或抑制蛋白翻译,在调控肿瘤干细胞分化与自我更新等生物学功能中发挥重要作用。本部分探讨miR-942在ESCC中的作用和分子机制,生物信息学软件预测下游靶基因并运用WB、荧光素酶报告基因及小干扰RNA技术等进行验证,为以miR-942为基础的靶向肿瘤干细胞治疗策略提供理论和实验依据。方法：● TOP-Flash/FOP-Flash双荧光素酶报告基因检测不同miR-942表达水平细胞内Wnt信号活性；●生物信息学软件预测miR-942的下游作用靶基因；● Western blotting检测蛋白表达水平；● 荧光素酶报道基因系统检测miR-942与sFRP4、GSK3β及TLE1的3‘UTR结合基序的结合活性；● 小干扰RNA阻断抑制内源性miR-942的ESCC细胞中sFRP4、GSK3β和TLE1的蛋白表达；基于此细胞模型采用肿瘤球形成实验、TOP-Flash/FOP-Flash双荧光素酶报告基因等技术研究对ESCC的影响。结果：●在ESCC细胞Eca109及Kyse510中,过表达miR-942显著增强TOP flash/FOP flash的荧光素酶活性,抑制内源性miR-942显著降低TOP flash/FOP flash的荧光素酶活性,而突变miR-942则无影响,提示miR-942可能激活经典的Wnt/β-catenin信号通路；●使用TargetScan6.2和Miranda,发现Wnt/β-catenin通路中的多功能负性调节分子sFRP4, GSK3β和TLE1的3’UTR端与miR-942有结合位点,提示上述三种蛋白可能为miR-942的潜在靶点;●在ESCC细胞系Eca109及Kyse510上调miR-942可显著降低sFRP4,GSK3β和TLE1的蛋白表达水平,同时抑制内源性miR-942可显著增加sFRP4, GSK3β和TLE1的蛋白表达水平,提示sFRP4、GSK3β和TLE1可能为miR-942的靶点蛋白；●荧光素酶报告基因结果显示,过表达miR-942显著抑制sFRP4,GSK3β和TLE1的3’UTRs的荧光素酶活性,抑制内源性的miR-942增加荧光素酶活性,提示sFRP4,GSK3β和TLE1是miR-942的直接作用靶点；●运用小干扰RNA敲减抑制内源性miR-942的ESCC细胞中sFRP4,GSK3β和TLE1的蛋白表达,可增强肿瘤球形成能力,显著增强TOP flash/FOP flash的荧光素酶活性,进一步提示miR-942可能通过直接调控sFRP4,GSK3β和TLE1激活经典的Wnt/β-catenin信号通路。结论：通过TOP flash/FOP flash荧光素酶活性检测,提示miR-942可能激活经典的Wnt-β-catenin信号通路；WB结果表明,上调miR-942可显著降低sFRP4,GSK3β和TLE1的蛋白表达水平；荧光素酶报告基因结果显示,过表达miR-942显著抑制sFRP4,GSK3β和TLE1的3‘UTRs的荧光素酶活性；进一步运用小干扰RNA敲减抑制内源性miR-942的ESCC细胞中sFRP4,GSK3β和TLE1的蛋白表达,可增强肿瘤球形成能力,显著增强TOP flash/FOP flash的荧光素酶活性。以上强烈提示,miR-942可能通过直接调控Wnt信号通路中关键负性调控分子sFRP4,GSK3β和TLE1激活经典的Wnt/β-catenin信号对食管癌CSCs干性产生影响。