论文部分内容阅读
目的：恶性黑色素瘤(malignant Melanoma, MM)是来源于黑色素细胞的高度恶性肿瘤,为人类第五大常见肿瘤,临床常用的治疗方法包括手术治疗,化学治疗,免疫治疗等,这些方法虽然在临床上取得了一定的疗效,但是很难彻底治愈肿瘤。近年来,随着癌基因和抑癌基因的相继发现,分子生物学手段的发展和完善,基因治疗成为肿瘤治疗研究中的热点,出现了多种基因治疗方法。这些方法虽然都取得了一定的抑瘤效果,但疗效并不理想。其主要原因是肿瘤是一个多因素、多环节、多阶段的复杂疾病,针对单一因素的治疗并不能根除肿瘤。因此,对现有治疗方法的联合成为基因治疗研究的趋势。本课题运用基因联合治疗的方法治疗小鼠恶性黑色素瘤,将活化小鼠特异性抗肿瘤免疫和抑制癌基因的表达两种治疗方法相联合,观察基因免疫治疗联合癌基因治疗对恶性黑色素瘤的治疗效果,为恶性黑色素瘤的治疗提供新的策略。方法：构建携带小鼠B7-H3基因的腺病毒表达载体(pAd-B7-H3)和携带小鼠Id-1短发夹RNA的慢病毒载体(Lent-Id 1-shRNA),通过体外实验和体内实验进行功能鉴定。将鼠B16恶性黑色素瘤细胞株接种于昆明小鼠皮下,构建恶性黑色素瘤模型,并将小鼠随机分为四组：①pAd-B7-H3+Lent-Id1-shRNA治疗组：②pAd-B7-H3治疗组；③Lent-Id1-shRNA治疗组；④未行任何治疗的小鼠作为未干预组。测量肿瘤直径,记录小鼠带瘤生存时间,TUNEL法检测肿瘤细胞凋亡情况,比较各组间肿瘤体积、小鼠生存率和肿瘤细胞凋亡率的差异。结果：1.构建重组腺病毒表达载体pAd-B7-H3,并获得了滴度为2×1011pfu/ml的病毒。pAd-B7-H3转染组与未转染组和pAd-CMV转染组相比,B7-H3表达明显升高(p<0.05)。pAd-B7-H3转染组细胞毒性T淋巴细胞(Cytotoxic T lymphocyte, CTL)杀伤活性(31.932±2.800%),与未转染组(16.027±2.847%)和pAd-CMV转染组(16.417±2.492%)相比均有统计学差异(p<0.05),而未干预组与pAd-CMV转染组比较差异无统计学意义(p>0.05),表明可以诱导产生特异性细胞毒性T淋巴细胞。2.构建了三个携带Id-1短发夹RNA的慢病毒表达载体(Lent-Id1-shRNA 1#-3#), Western blot结果表明Lent-Id1-shRNA 1#对B16细胞中Id-1的抑制作用较强(p<0.05)；MTT结果显示,Lent-Id1-shRNA 1#具有较强的抑瘤效果(p<0.05)。3. pAd-B7-H3治疗组、Lent-Id1-shRNA治疗组与对照组相比肿瘤生长明显减缓。接种28天后,pAd-B7-H3治疗组肿瘤体积(2662.01±1909.67mm3)和pAd-CMV治疗组(8226.89±4063.57 mm3)、未干预组(9656.65±5024.34 mm3)比较均有统计学差异(p<0.05),而pAd-CMV治疗组和未干预组之间无明显差异(p>0.05)。Lent-Id1-shRNA治疗组(2539.97±1564.71 mm3)和Lent-NC-GFP治疗组(8783.29±3857.61mm3)、未干预组(9656.65±5024.34 mm3)比较均有统计学差异(p<0.05),而Lent-NC-GFP治疗组和未干预组之间无明显差异(p>0.05)。4. pAd-B7-H3+Lent-Id1-shRNA治疗组肿瘤体积(144.67±252.37 mm3)明显小于pAd-B7-H3治疗组、Lent-Id1-shRNA治疗组(p<0.05)。结论：1.B7-H3疫苗和Lent-Id1-shRNA单独治疗昆明小鼠皮下恶性黑色素瘤,均能显著抑制肿瘤的生长(约为未干预组肿瘤体积的2／3),但恶性黑色素瘤的治愈率为0。2.B7-H3疫苗和Lent-Id1-shRNA联合治疗,可使恶性黑色素瘤的治愈率达到66.67%。联合治疗组中的未治愈者的带瘤生存时间较单一治疗明显延长。B7-H3疫苗联合沉默Id1基因为临床治疗恶性黑色素瘤的治疗提供了新的思路。