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目的:1.检测肝癌组织中UBE2L3的表达水平。2.探讨UBE2L3在肝癌细胞增殖与凋亡过程中发挥的作用。3.阐明UBE2L3影响肝癌细胞增殖与凋亡的分子机制。4.裸鼠原位移植瘤模型检测UBE2L3在体内的作用。方法:1.NCBI GEO数据库(GSE14520;GSE25097)分析UBE2L3在肝癌病人癌组织及癌旁组织中的表达。TCGA数据库分析UBE2L3的表达高低对病人总生存期和无病生存期的影响。RT-q PCR检测UBE2L3在66例肝癌病人癌组织及癌旁组织中mRNA的表达水平。Western blot检测UBE2L3在66例肝癌病人癌组织及癌旁组织中的蛋白表达水平。2.在肝癌细胞中基因敲减/敲除UBE2L3的表达,并利用台盼蓝排斥实验检测肝癌细胞的增殖;平板集落实验检测肝癌细胞的集落形成能力;软琼脂克隆形成实验检测肝癌细胞的锚定非依赖生长能力。3.在肝癌细胞中基因敲减/敲除UBE2L3的表达,并利用流式细胞术检测肝癌细胞的凋亡;Western blot检测凋亡相关因子的表达。4.在肝癌细胞中敲除UBE2L3的表达,并构建裸鼠异位移植瘤模型,检测敲除UBE2L3对肝细胞癌生长的影响。5.在肝癌细胞中过表达UBE2L3,并利用台盼蓝排斥实验检测肝癌细胞的增殖;平板集落实验检测肝癌细胞的集落形成能力;软琼脂克隆形成实验检测肝癌细胞的锚定非依赖生长能力;流式细胞术检测肝癌细胞的凋亡。6.RT-qPCR检测UBE2L3基因敲减/敲除或过表达对p65 mRNA表达水平的影响;Western blot检测UBE2L3基因敲减/敲除或过表达对p65蛋白表达水平及p65磷酸化水平的影响。在肝癌细胞中基因敲减UBE2L3,ICC检测p65在UBE2L3基因敲减时的表达及亚细胞定位情况;分别提取胞浆胞核蛋白,Western blot检测p65在UBE2L3基因敲减时的表达及亚细胞定位情况。7.RT-qPCR检测UBE2L3基因敲减/敲除或过表达对p65下游基因PUMA mRNA表达水平的影响;Western blot检测UBE2L3基因敲减/敲除或过表达对PUMA蛋白表达水平的影响。8.Western blot检测p65抑制剂JSH-23对UBE2L3敲除所致下游信号通路改变的影响;台盼蓝排斥实验检测p65抑制剂JSH-23对UBE2L3敲除所致肝癌细胞增殖的影响;流式细胞术检测p65抑制剂JSH-23对UBE2L3敲除所致肝癌细胞凋亡的影响。9.在肝癌细胞中共转染RL-TK、NF-κB luciferase reporter plasmid及靶向UBE2L3的基因敲减shRNA质粒,或共转染RL-TK、NF-κB luciferase reporter plasmid及GSK3β过表达质粒。利用双荧光素酶报告系统检测基因敲减UBE2L3或过表达GSK3β对NF-κB转录活性的影响。RT-qPCR检测GSK3β基因敲减/过表达对p65 mRNA表达水平的影响;Western blot检测GSK3β基因敲减/过表达对p65蛋白表达水平及p65磷酸化水平的影响。10.RT-qPCR检测UBE2L3基因敲减/敲除或过表达对GSK3βmRNA表达水平的影响;Western blot检测UBE2L3基因敲减/敲除或过表达对GSK3β蛋白表达水平及GSK3β磷酸化水平的影响。在肝癌细胞中过表达UBE2L3并加入CHX处理,Western blot检测UBE2L3对GSK3β蛋白稳定性的影响。在肝癌细胞中过表达UBE2L3并加入MG132处理,Western blot检测UBE2L3降解GSK3β蛋白是否通过泛素-蛋白酶体降解途径。Co-IP检测UBE2L3与GSK3β在肝癌细胞中是否存在内源性及外源性结合。在肝癌细胞中基因敲减/敲除或过表达UBE2L3并加入MG132处理,Co-IP检测GSK3β蛋白的泛素化水平。11.Western blot检测基因敲减GSK3β或GSK3β抑制剂1-Azakenpaullone处理对UBE2L3敲除所致下游信号通路改变的影响;台盼蓝排斥实验检测基因敲减GSK3β或GSK3β抑制剂1-Azakenpaullone对UBE2L3敲除所致肝癌细胞增殖的影响;流式细胞术检测基因敲减GSK3β或GSK3β抑制剂1-Azakenpaullone对UBE2L3敲除所致肝癌细胞凋亡的影响。12.在肝癌细胞中敲除UBE2L3的表达,在此基础上基因敲减GSK3β,并构建裸鼠原位移植瘤模型,p65抑制剂JSH-23处理两周,检测敲除UBE2L3及基因敲减GSK3β或p65抑制剂对肝癌增殖的影响。结果:1.NCBI GEO数据库(GSE14520;GSE25097)分析显示UBE2L3在肝癌病人癌组织中的表达显著高于癌旁组织。TCGA数据库分析显示UBE2L3高表达的病人总生存期和无病生存期显著低于UBE2L3低表达的病人。UBE2L3 mRNA的表达水平在肝癌病人的癌组织中高于癌旁组织;UBE2L3的蛋白表达水平在50例(75.8%)肝癌病人的癌组织中表达高于癌旁组织,统计分析结果也显示UBE2L3在肝癌组织中的蛋白表达水平显著高于癌旁组织。2.在肝癌细胞中基因敲减/敲除UBE2L3的表达可抑制肝癌细胞的增殖,肝癌细胞的集落形成能力以及肝癌细胞的锚定非依赖生长能力。3.在肝癌细胞中基因敲减/敲除UBE2L3的表达可促进肝癌细胞的凋亡及凋亡相关因子的表达。4.在肝癌细胞中敲除UBE2L3的表达可抑制裸鼠异位移植瘤的生长。5.在肝癌细胞中过表达UBE2L3可促进肝癌细胞的增殖,肝癌细胞的集落形成能力以及肝癌细胞的锚定非依赖生长能力;并且有抑制肝癌细胞凋亡的趋势。6.UBE2L3基因敲减/敲除可增加p65的mRNA表达水平,蛋白表达水平及磷酸化水平;UBE2L3过表达可降低p65的mRNA表达水平,蛋白表达水平及磷酸化水平。UBE2L3基因敲减可增加p65的表达及其核转位。7.UBE2L3基因敲减/敲除可增加PUMA的mRNA及蛋白表达水平;UBE2L3过表达可降低PUMA的mRNA及蛋白表达水平。8.p65抑制剂JSH-23可逆转UBE2L3敲除所致下游信号通路的改变以及UBE2L3敲除对细胞增殖的抑制作用和对细胞凋亡的促进作用。9.UBE2L3基因敲减或GSK3β过表达均使NF-κB的转录活性增强。GSK3β基因敲减可降低p65的mRNA表达水平,蛋白表达水平及磷酸化水平;GSK3β过表达可增加p65的mRNA表达水平,蛋白表达水平及磷酸化水平。10.UBE2L3基因敲减/敲除或过表达对GSK3βmRNA表达水平无明显作用;UBE2L3基因敲减/敲除可促进GSK3β的蛋白表达并抑制其磷酸化;相反,UBE2L3过表达可抑制GSK3β的蛋白表达并促进其磷酸化。蛋白合成受阻后,UBE2L3过表达可促进GSK3β蛋白质的降解。UBE2L3过表达及蛋白酶体抑制剂MG132的处理显示UBE2L3降解GSK3β蛋白是通过泛素-蛋白酶体降解途径。Co-IP检测结果显示内源性和外源性UBE2L3与GSK3β均可相互作用。UBE2L3基因敲减/敲除可降低GSK3β蛋白的泛素化水平,UBE2L3过表达可增加GSK3β蛋白的泛素化水平。11.基因敲减GSK3β或GSK3β抑制剂1-Azakenpaullone可逆转UBE2L3敲除所致下游信号通路的改变以及UBE2L3敲除对细胞增殖的抑制作用和对细胞凋亡的促进作用。12.在肝癌细胞中敲除UBE2L3的表达可抑制裸鼠原位移植瘤的生长。基因敲减GSK3β或p65抑制剂JSH-23可逆转这种抑制作用。结论:UBE2L3在肝癌病人的癌组织中呈现高表达;基因敲减/敲除UBE2L3可抑制肝癌细胞的增殖,促进肝癌细胞的凋亡,还可抑制裸鼠异位移植瘤的生长。其机制为,基因敲减/敲除UBE2L3可增加GSK3β的蛋白稳定性,促进其激活;从而使得下游的p65表达增加,发生核转位;再去激活凋亡促进因子PUMA的表达。在体内,敲除UBE2L3还可抑制裸鼠原位移植瘤的生长。此外,基因敲减GSK3β或p65抑制剂JSH-23可逆转UBE2L3的上述作用。综上提示,UBE2L3作为一种肿瘤促进因子在肝细胞癌的发生发展中有着重要的作用。