论文部分内容阅读
目的:研究亨廷顿蛋白(Huntingtin, Htt)氨基末端片段Htt-586片段代谢中自噬/溶酶体途径和泛素-蛋白酶体途径的作用;初步探讨野生型与突变型Htt-586片段对高尔基体形态与功能的影响。方法:采用慢病毒表达系统建立高分化PC12细胞稳定表达野生型与突变型Htt-586片段的亨廷顿舞蹈病的细胞模型。利用Western Blot法和免疫荧光双标记法检测PC12细胞模型中自噬相关蛋白LC3和Beclin1的表达情况。运用Western Blot法检测自噬抑制剂(3-MA)、自噬激活剂(rapamycin)和蛋白酶体抑制剂(lactacystin和MG132)对Htt-586蛋白在细胞内蓄积的影响。运用免疫荧光技术检测表达野生型或突变型Htt-586片段的高分化PC12细胞中高尔基体形态的变化。运用ELISA,Western Blot,免疫荧光技术检测表达野生型或突变型Htt-586片段高分化PC12细胞模型中神经营养因子BDNF的表达。结果:利用慢病毒表达系统,建立了稳定表达野生型与突变型Htt-586片段的高分化PC12细胞株;蛋白酶体抑制剂乳胞素(Lactacystin和MG132)降低蛋白酶体活性后,Htt-586蛋白蓄积显著增加;自噬抑制剂(3-MA)与自噬激活剂(rapamycin)对Htt-586蛋白在细胞内的蓄积影响不明显;免疫荧光双标记结果显示高尔基体在突变型PC12细胞模型中高尔基体体积部分缩小,部分呈现弥散解离状态;Western Blot与免疫荧光双标记结果显示,在突变型细胞模型中胞内pro-BDNF表达增加,而mature-BDNF表达减少;ELISA结果显示,突变型PC12细胞其培养基中分泌的mature-BDNF量显著减少。结论:成功建立慢病毒介导的野生型与突变型Htt-586片段在高分化PC12细胞中的稳定表达,该稳转株分别命名为PC12-Htt586-18Q和PC12-Htt586-100Q。发现突变型片段代谢能主要是通过泛素-蛋白酶体途径代谢,并非由自噬/溶酶体途径代谢。表达突变型片段通过影响高尔基体的形态与功能,从而影响BDNF的成熟与分泌。这些研究将为氨基末端Htt片段在细胞内发挥的生理与病理功能的研究打开新的思路。