松褐天牛、棉卷叶野螟泛素基因的克隆与表达

• 作 者: 张宇宏
• 机 构: 华南农业大学
• 出 处: 华南农业大学
• 发表日期: 2009年期
• 关键词: 松褐天牛 棉卷叶野螟 基因克隆 聚合酶链式反应 泛素基因

松褐天牛属于鞘翅目天牛科，不仅为害松树，且是传播松材线虫病的病原。棉卷叶野螟属鳞翅目螟蛾科，是20世纪80年代后危害木槿的主要害虫。泛素(Ub)在真核细胞中具有重要的功能意义，泛素参与的泛素—蛋白酶水解途径是真核细胞中蛋白质降解的主要途径之一，该系统在转录水平的调节、蛋白质的降解、蛋白质稳定状态的调节、程序性细胞死亡、细胞周期的控制和胁迫响应等过程中起重要作用。本研究用聚合酶链式反应(PCR)及反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)法克隆到松褐天牛和棉卷叶野螟泛素基因，并成功进行原核表达，为进一步研究泛素基因在昆虫体内的分子机理奠定了基础。主要研究结果如下：
抽提及纯化松褐天牛总DNA及总RNA，分别用PCR及RT-PCR的方法扩增松褐天牛总DNA及cDNA的泛素基因并测序，获得泛素基因编码区，该片段长度为228bp，编码76个氨基酸。松褐天牛泛素基因GenBank登录号为EU433567，与斜纹夜蛾等10种昆虫仅有1—4个氨基酸不同，同源性大于94％。系统发育树显示松褐天牛与斜纹夜蛾、草地贪夜蛾遗传距离较近，通过同源建模获得了该基因编码蛋白的理论三维结构。将松褐天牛泛素基因与pET—32a(+)连接，构建原核表达载体pET—32a—ub1：经IPTG诱导，松褐天牛泛素基因在大肠杆菌BL21(DE3)中高效表达，并经Western blotting分析检测了该基因的原核表达。
抽提及纯化棉卷叶野螟总DNA及总RNA，分别用PCR及RT-PCR的方法扩增棉卷叶野螟总DNA及cDNA的泛素基因并测序，获得泛素基因编码区，该片段长度为228bp，编码76个氨基酸。棉卷叶野螟泛素基因GenBank登录号为EU580145，与草地贪夜蛾等10种昆虫仅有1—5个氨基酸不同，同源性大于93％。系统发育树显示棉卷叶野螟与斜纹夜蛾遗传距离较近，并获得了棉卷叶野螟泛素蛋白理论三维结构。将棉卷叶野螟泛素基因与pET—32a(+)连接，构建原核表达载体pET—32a—ub2；经IPTG诱导，棉卷叶野螟泛素基因在大肠杆菌BL21(DE3)中表达，并经Western blotting分析检测了该基因的原核表达。
本论文用从棉卷叶野螟和松褐天牛幼虫中克隆了泛素基因，运用生物信息学方法对该基因进行序列分析，并实现了该基因的原核表达，为进一步研究棉卷叶野螟和松褐天牛泛素的生理功能奠定基础。