野生甲壳动物白斑综合征病毒多态位点分析及螯虾酚氧化酶对该病毒的免疫应答

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甲壳类动物在水产养殖中占据重要地位,但是流行性疾病的暴发导致其产量明显下降,尤其是细菌、真菌、病毒等的感染。为完善水产养殖病害的防御监测机制,从根源上探究白斑综合征病毒的特点,为水产养殖中该病毒的传播和防治提供理论参考。本文以甲壳类动物为实验对象,巢式PCR、电泳、克隆、转化等相关分子生物学技术与Primer5.0、DNA star、SPSS等相关软件联合使用,从以下三个方面探究白斑综合征病毒(WSSV)的相关免疫学特征:  (1)野生甲壳类动物携带白斑综合征病毒(white spot syndrome virus, WSSV)的检测。  利用巢式PCR技术检测烟台海域不同年份野生甲壳类动物携带WSSV的情况,其中6个品种包括:豆形拳蟹(Philyra pisum),圆球股窗蟹(Scopimera globosa),平背蜞(Gaetice depressus),寄居蟹(Pagurus japonicus),日本鼓虾(Alpheus japonicas)和鲜明鼓虾(Alpheus distinguendus)是首次作为该病毒的天然宿主报道。结果还显示病毒的携带量和携带率在不同的年份中表现并不相同。因此,监测天然甲壳动物中WSSV的携带情况有助于我们预防该病毒的传播和可能产生的爆发风险。  (2)白斑综合征病毒(WSSV)多态位点基因结构的分析。  本实验选用的样品采集于2015年山东省烟台市周边的海域,包括野生甲壳类动物鲜明鼓虾(15AD)和日本蟳(15CJ),对其携带的WSSV进行多肽位点分析。结果显示:Ⅰ.根据可变区ORF23/24或ORF14/15的序列比对,都能得出15AD和15CJ毒株来源于WSSV-TW;Ⅱ.可变区ORF94和ORF125可作为探究该病毒流行病学的依据;Ⅲ.同源区hr9和转座酶对病毒来源的分析结果不一致,可见这两个多态位点可能一般不用来探究病毒的起源。Ⅳ.通过与养殖甲壳类动物携带的WSSV对比,未发现更接近原始状态的毒株。  (3)注射白斑综合征病毒对克氏原螯虾酚氧化酶活力的影响。  以克氏原螯虾(Procambarus clarkii)为实验材料,选用WSSV为研究对象,以致病菌嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila, Ah)和非致病菌大肠杆菌(DH5α)为参照物,对螯虾(P. clarkii)进行免疫注射。在0 h~72 h之间定时检测螯虾血细胞和肝胰脏中酚氧化酶(Phenoloxidase, PO)活力变化。结果显示:Ⅰ.0.1 mg/mL和1 mg/mL胰蛋白酶处理样品后,样品间差异不显著。Ⅱ.加胰蛋白酶处理与未加胰蛋白酶相比,供试螯虾PO活力均升高。Ⅲ.未加胰蛋白酶与加胰蛋白酶表现出相似的特征,WSSV和Ah注射组与对照组相比均表现为,12 h~48 h PO活力显著高于对照组,并且在48 h达到最大值,72 h时基本恢复正常;注射DH5α组与对照组相比没有显著性变化。可见感染WSSV后,克氏原螯虾体内酚氧化酶活力发生了变化,由此推测,PO参与了螯虾体内抵御病毒的免疫反应。
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