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桑叶的乳汁中含有高浓度的糖类似生物碱，如：D-AB1、脱氧野尻霉素（DNJ）、1,4-二脱氧-1,4-亚氨基-D-核糖醇等，对α-葡萄糖苷酶（EC.3.2.1.20）具有抑制作用，但不能抑制β-呋喃果糖苷酶（β-FFase，EC.3.2.1.26）的活性。DNJ对蓖麻蚕、甘蓝夜蛾等非食桑昆虫幼虫具有明显的毒性，阻碍幼虫的生长。家蚕（Bombyx mori）是以桑叶为唯一营养来源的昆虫，DNJ等生物碱对家蚕并没有表现出毒性作用，说明家蚕具有抵抗桑叶生物碱防御系统的能力。继家蚕β-FFase基因（BmSuc1）被克隆鉴定之后，来自鳞翅目、鞘翅目等多种昆虫的β-FFase基因先后被发现。然而，BmSUC1作为蔗糖水解酶，其在家蚕避免生物碱毒害作用的分子调控机制中的功能还不明确；关于昆虫β-FFase的酶活中心、关键酶活性位点及底物结合位点尚缺乏调查和了解。 β-FFase属于糖苷水解酶GH32家族。为了调查家蚕β-FFase的活性位点及其活性特征，本研究通过 BmSUC1与其他物种β-FFase同源序列的比对，发现GH32家族酶中与酶活相关的三个保守结构域的关键氨基酸（WMNDPNG，RDP， EC）在BmSUC1中同样是保守的。利用重叠延伸PCR的方法将Asp63、Asp181、Glu234分别定点突变成 Ala，构建基于三个突变（D63A、D181A、E234A）的pFastBac Dual重组表达载体。利用大肠杆菌-杆状病毒（Bac-to-Bac）表达系统在家蚕卵巢细胞（BmN）中进行体外重组蛋白的表达、纯化和活性测定。最后采用蒸发光检测器-HPLC法对活性显著增加的D181A突变型的酶活特性进行定性和定量鉴定。本研究得到以下主要结果： 1）分别收集真核表达体系的各组分，即细胞外（培养液）、细胞内上清和细胞内沉淀），进行SDS-PAGE和Western blot分析。结果显示重组蛋白主要存在于细胞培养液中，分子量约56KDa，与理论预测值基本一致。 2）通过大量表达并经Ni-NTA亲和色谱层析柱分离纯化重组蛋白和Western blot分析，获得了纯度较高的的野生型BmSUC1和三个突变型重组蛋白。 3）以蔗糖为底物进行酶活反应，利用DNS法检测酶的活性。结果表明，野生型BmSUC1的最适pH为7.0，最适反应温度为30℃，而D63A和E234A突变在pH5～9、反应温度15～60℃范围内均表现出几乎没有活性，说明该两个氨基酸位点是BmSUC1的关键性活性位点。有趣的是，D181A的活性显著高于野生型BmSUC1，其最适反应温度也为30℃，而最适pH为6.0。 4）酶的活性动力学分析结果表明D181A突变型对蔗糖和棉籽糖的底物亲和性都高于野生型BmSUC1。HPLC分析发现BmSUC1和D181A催化的酶促反应产物的中均含有果糖、葡萄糖、蔗糖、1-蔗果三糖和6-蔗果三糖，表明 D181A和 BmSUC1一样，不仅具有蔗糖水解酶的活性，同时表现出果糖基转移酶的活性，与GH32家族的酶活特性一致，并且D181A的水解酶活性和果糖基转移酶活性都显著高于野生型BmSUC1。 总之，本研究通过定点突变的方法对 BmSUC1的预测活性位点进行功能性探究，发现D63A、D181A和E234A突变对酶的活性均产生了明显影响。细菌、真菌及植物β-FFase的晶体结构解析结果表明，D63起亲核攻击作用，E234则作为酸碱催化位点起到质子传递作用，对于 BmSUC1来说，该两个位点可能具有同样重要的功能。一般认为D181位点对底物的过渡态起到稳定作用，至于D181A突变导致BmSUC1活性的显著增加的原因，尚需进一步的研究探讨。