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研究目的：
尝试制备新型MR对比剂长循环SPIO(Superparamagnetic Iron Oxide)脂质体纳米微粒,并对其理化性质及药效学进行测定和初步评价。
材料和方法
1 新型MR对比剂长循环SPIO脂质体纳米微粒的制备及理化性质的测定
1.1长循环SPIO脂质体纳米微粒的制备
分三步完成:(1)按摩尔比20:1精密称取一定量DSPG、DSPE-PEG2000,采用薄膜分散法合成长循环空白脂质体纳米微粒；(2)采用化学共沉淀法,在碱性条件下与月桂酸反应形成月桂酸稳定的SPIO纳米微粒；(3)将上述反应产物以一定比例混合,加入TES缓冲液(5mM,PH=7.0),透析3天,过凝胶柱去除过大的脂质体及游离的磷脂。
1.2长循环SPIO脂质体纳米微粒理化性质的测定
2 新型MR对比剂长循环SPIO脂质体纳米微粒药效学的初步评价
2.1巨噬细胞的体外吞噬实验:用含10％胎牛血清(FCS)的DMEM培养基于37℃,5％CO2条件下培养RAW264.7细胞24h后,细胞达到80-90％汇合,以0.025％胰酶-0.2％EDTA消化细胞,接种于6孔细胞培养板,5×105个/孔,孵化24小时后,用PBS液洗三遍后,加入含铁量800μg的空白SPIO和长循环SPIO脂质体的DMEM全培溶液2ml,孵化24h后,用PBS液洗三遍,以未加入SPIO溶液的细胞作为空白对照,每孔分别加入1ml4％的多聚甲醛溶液,固定20分钟后,加入由2％亚铁氰化钾溶液和2％盐酸(体积比2:1)混合液1ml,于37℃,孵化30分钟后,用PBS液洗三遍,倒置显微镜下观察,拍照比较RAW264.7细胞与含上述溶液培养基孵化24h后经普鲁士蓝染色后颜色的差异。
2.2小鼠药物体内分布实验
2.2.1实验动物:C57BL/6J雄性小鼠6只,体重12～15g,由南方医科大学基础医学院神经生物教研室馈赠,实验动物符合医学实验动物标准。
2.2.2主要仪器与试剂:石蜡切片机(德国Leica RM2155),Olympus显微镜(日本奥林巴斯公司),空白SPIO(南方医院影像中心许乙凯教授提供),长循环SPIO脂质体溶液(按前述方法制备)。
2.2.3动物实验研究方法:上述6只小鼠,随机设为空白对照组(n=2)、空白SPIO组(n=2)、长循环SPIO脂质体组(n=2)；经小鼠尾静脉分别缓慢注射0.05ml生理盐水、空白SPIO溶液以及长循环SPIO脂质体溶液(10mgFe/kg)；12小时后行颈椎脱臼法处死动物,快速取其肝脏、脾脏、心脏、肺脏以及肾脏组织,用10％福尔马林固定,常规石蜡包埋、切片,做Perls Prussian-blue染色,于光学显微镜下观察。
2.3荷肺癌裸鼠MR成像实验
2.3.1实验动物和瘤株:SPF级4周龄BALB/C雄性裸鼠20只,体重15～19g,按照细胞悬液密度约1×107个/ml,于上述BALB/c裸鼠右侧腋部皮下接种人A549细胞悬液0.2ml,无菌饲养2～3周。
2.3.2实验动物分组:采用随机数字法将其分成两组:空白SPIO组(n=10)和长循环SPIO脂质体组(n=10)。
2.3.3 MRI扫描方法:平扫采用膝关节线圈,扫描序列参数如下:FSE-T2WI(TR:4000ms,TE:84.7ms),SE-T1WI(TR:420ms,TE:10.6ms),FOV:10×10cm,层厚1.5mm。平扫结束后,于上述裸鼠尾静脉分别注射对比剂空白SPIO以及长循环SPIO脂质体(10mgFe/kg),并于5min、30min、1h、3h、6h、9h、12h、24h后行T2WI-MR增强扫描,扫描序列及参数同平扫。扫描结束后处死裸鼠,分别取两组肿瘤组织行普鲁士蓝染色,光学显微镜下观察。
2.3.4图像观察与测量:在T2WI像上测量平扫及增强后两组实验动物各时间点肝脏及肿瘤感兴趣区的信号强度及背景噪声标准差,计算出信噪比,绘制两组实验动物平扫及增强后各时间点肝脏及肿瘤的信噪比-时间动态变化曲线,并计算两组实验动物平扫及增强后12h肝脏及肿瘤的信噪比下降百分比。
2.3.5统计学分析:采用SPSS13.0统计软件包,采用配对样本t检验比较各组动物肿瘤及肝脏平扫和增强后12h信噪比有无差异；采用协方差分析在扣除各组动物肝脏及肿瘤初始信噪比差异下比较两组动物肝脏及肿瘤增强12h后信噪比有无显著性差异。P<0.05认为有显著性差异。
2.4药物细胞毒性实验(MTT法):吸取复苏后培养的人肝细胞HL-7702细胞悬液离心洗涤,1000rpm,3min。培养液重悬细胞,细胞计数,以每孔5×103个细胞接种于96孔板中,37℃,5％CO2培养24小时。弃去上清液,用D-hanks液洗两遍后,分别加入空白SPIO溶液及长循环SPIO脂质体溶液,浓度分别为每孔铁含量为10μg,20μg,40μg,80μg,120μg,160μg和200μg的上述纳米粒混悬液和20％胎牛血清的培养液200μl,每组设3个复孔。另外,以仅含培养基,不含细胞的作为调零孔；以仅含正常培养细胞的为正常对照孔；以只加入上述纳米粒的为样品对照孔。培养24小时后,加入浓度为5mg/ml的MTT的D-hanks溶液,每孔20μl,于37℃,5％CO2培养箱中继续孵化4h后,吸去上清液,每孔加入200μl二甲基亚砜,于平板震荡仪上震荡10分钟,在490nm的波长处于酶标仪中测定吸光度值(OD值),比色时,以空白孔调零。计算细胞存活率,公式为:细胞存活率=(样品孔的OD值-样品对照孔的OD值)/正常对照孔的OD值。
结论
本文制备的长循环SPIO脂质体纳米微粒粒径大小适宜,分布均匀,在体内外均有较好的抗巨噬系统吞噬功能,在体内实现了长循环,使SPIO不仅仅局限作用于网状内皮系统,对非网状内皮系统肿瘤也具有良好的T2负性被动靶向强化效果,另外降低了SPIO对细胞的毒性作用。
不足之处
本文仅是初步研究,局限于新型MR对比剂长循环SPIO脂质体的初步合成及其长循环功能和被动靶向作用的验证,药物制备工艺尚不完善,且未在脂质体表面联上特异性功能基团(抗体或受体)凸显其主动靶向作用,这在我们的后续实验中将得到进一步体现。
研究目的：
前瞻性研究MR扩散加权成像在鉴别中央型肺癌与继发阻塞性肺实变中的价值。
材料和方法
1 临床资料:对2009年3月1日～2010年2月21日间经病理确诊为肺癌的20例符合以下条件的患者行MR胸部扫描:(1)已有影像学资料(平片、CT或PET-CT)提示肺癌合并肺不张；(2)未接受过放疗、化疗等抗肿瘤治疗；(3)一般情况良好,无严重心血管疾病,无肝肾功能障碍,能配合完成MR检查；(4)体内无金属物(心脏支架、起搏器、心脏人工瓣膜等)或其他MR检查禁忌。
2 MR扫描方法:采用GE 1.5T超导MR扫描仪,所有病例均行T1-SE、T2*FGRE、T2-FRFSE、FIESTA以及DWI各序列的检查,所有序列均采用外周脉搏及呼吸门控。
3 图像分析:由2位经验丰富的影像诊断医师经商议后作出结论。选择显示肿瘤与阻塞性肺实变并存或邻近的2个相邻层面作为感兴趣区(region of interest,ROI)所选层面。
弥散图像测量:在ADC图上分别测量各个ROI的ADC值,在2种b值的DWI图像上测量肿瘤与阻塞性肺实变的信号强度平均值、图像背景噪声平均值和标准差。计算DWI上病变区(肿瘤及阻塞性肺实变)的图像信噪比、肿瘤-阻塞性肺实变的信号强度比和肿瘤-阻塞性肺实变的对比噪声比。
常规图像信号强度测量:采用同样的方法,在T2*FGRE、T2-FRFSE、FIESTA各序列上测量肿瘤及阻塞性肺实变区的信号强度值,计算相应信号强度比。
4 统计学分析
采用SPSS for windows(SPSS13.0)统计软件进行数据录入及统计分析。对两种b值DWI图像病变区(包括瘤体与阻塞性实变区)SNR、SIR、CNR的比较,对相同b值不同病变区ADC值差异,对不同b值时相同病变区ADC值的差异,DWI与T2*FGRE、T2-FRFSE、FIESTA图像的SIR比较以及不同b值相同病理类型肿瘤瘤体ADC值差异均采用配对样本t检验；对相同b值不同病理类型瘤体ADC值的比较采用完全随机设计的单因素方差分析,多重比较选用LSD法。P<0.05认为有显著性差异。
结论
伴有阻塞性肺实变的中央型肺癌其瘤体在DWI上呈明亮高信号,继发的阻塞性肺实变信号较低:瘤体的平均ADC值显著低于其继发阻塞性肺实变的平均ADC值。ADC值可以用作鉴别中央型肺癌和继发阻塞性肺实变的一个有用的辅助诊断参数。