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目的利用分子生物学技术，体外扩增弓形虫RH株致密颗粒蛋白4(GRA4)基因和表面抗原2(SAG2)基因构建大肠杆菌-分支杆菌穿梭质粒，经电转化方法，将两个基因片断的穿梭质粒转化到耻垢分支杆菌(Mycobacteriumsmegmatismc2155)和卡介苗(BacillusCalmette-Guerin，BCG)中，免疫接种小鼠，观察其诱导小鼠产生的免疫应答及对弓形虫感染的免疫保护性。
方法①根据GRA4基因序列和SAG2基因序列及ps3000表达载体的要求，自行设计与合成两对引物，用聚合酶链式反应(PCR)技术分别从弓形虫RH株基因组DNA中扩增GRA4基因片段和SAG2基因片断，并插入pGEMT载体，进行PCR、双酶切及测序鉴定。②亚克隆法构建ps3000-GRA4和ps3000-SAG2大肠杆菌-分支杆菌穿梭质粒，经电转化方法，将两个基因片断的穿梭质粒转化到耻垢分支杆菌和卡介苗中，用重组耻垢分支杆菌免疫小鼠，Western-blotting方法检测免疫小鼠血清中的抗弓形虫的抗体。③免疫保护性试验共设6个组，分别是PBS对照组、BCG空白菌组、BCG-空白载体组、BCG-SAG2组、BCG-GRA4组、BCG-SAG2+GRA4组。用重组BCG疫苗经腹腔注射，免疫接种对应组的小鼠，对照组每只小鼠注射100μLPBS缓冲液，其他试验组每只小鼠接种100μL菌液(约含106个CFU)，间隔两周再加强免疫一次。免疫保护性试验分别在免疫后4、6、8周三次处死小鼠(每次处死3只)，取脾细胞检测其细胞因子水平(IL-10和IFN-γ)作T淋巴细胞亚群计数和体外淋巴细胞转化实验，以及用间接ELISA法测定IgG和IgM抗体水平作免疫指标测定。攻虫试验小鼠，在末次免疫3周后，用RH株弓形虫速殖子攻击(50个/只)，观察小鼠存活情况。
结果①用所合成的2对引物分别成功地从弓形虫RH株基因组DNA中扩增出大小约为1000碱基对(bp)的GRA4基因片段和大小约为500bp的SAG2基因片段；pGEMT-GRA4和pGEMT-SAG2重组质粒的菌落PCR产物及双酶切产物均与来自速殖子基因组DNA的PCR产物大小基本一致，pGEMT-GRA4的测序结果与GenBankTM上序列号为M76432的弓形虫GRA4基因序列的同源性为100％。pGEMT-SAG2的测序结果也与GenBankTM上序列号为AF249698的弓形虫SAG2基因序列的同源性达99.99％，只存在一个同义突变。②成功构建穿梭质粒ps3000-GRA4和ps3000-SAG2。将小鼠的免疫血清进行免疫印迹分析，弓形虫GRA4重组蛋白在40.0kD处出现一条被小鼠免疫血清(用GRA4重组耻垢分支杆菌免疫的小鼠血清，滴度1：100)所识别的蛋白条带，说明小鼠血清中含有抗弓形虫蛋白的抗体，间接表明耻垢分支杆菌在小鼠体内表达出了弓形虫GRA4重组蛋白；弓形虫SAG2重组蛋白在18.0kD处出现一条被小鼠免疫血清(用SAG2重组耻垢分支杆菌免疫的小鼠血清，滴度1：100)所识别的蛋白条带，说明小鼠血清中含有抗弓形虫SAG2蛋白的抗体，间接证明耻垢分支杆菌在小鼠体内表达出了弓形虫SAG2重组蛋白，为后面重组BCG疫苗的研究提供了依据。③在免疫保护性试验中，小鼠免疫后各免疫指标测定结果如下。T淋巴细胞亚群分析：免疫后4周各试验组CD3+CD4+的OD值和CD3+CD4+/CD3+CD8+的比值最高，随着时间的延长逐渐降低。BCG-SAG2+GRA4组的CD3+CD4+的OD值和CD3+CD4+/CD3+CD8+的比值最高，与PBS对照组差异显著(P＜0.05)。各试验组CD3+CD8+的OD值最高峰出现在免疫后6周，其中以BCG-SAG2+GRA4组的CD3+CD8+的OD值最高，与PBS对照组差异显著(P＜0.05)；小鼠免疫血清中IgG和IgM抗体结果表明，BCG-SAG2组、BCG-GRA4组和BCG-SAG2+GRA4组高水平的抗弓形虫IgG和IgM抗体出现在免疫后6、8周，PBS小鼠组、BCG空白菌组、BCG-空白载体组没有抗弓形虫的抗体产生；脾淋巴细胞增殖试验结果显示，BCG-空白菌组、BCG-空白载体组、BCG-SAG2组、BCG-GRA4组和BCG-SAG2+GRA4组的刺激指数与PBS对照组存在显著差异(P＜0.05)；免疫鼠细胞因子IFN-γ及IL-10的检测结果表明，各试验组IL-10最高水平出现在免疫后8周，其中以BCG-SAG2组的IL-10的水平最高，各试验组IFN-γ最高水平出现在免疫后6周，其中以BCG-空白载体组的IFN-γ的水平最高，各试验组的细胞因子水平几乎都与PBS对照组存在显著差异(P＜0.05)。④在攻虫试验中，小鼠攻击感染结果：BCG-SAG2组、BCG-SAG2+GRA4组和BCG-GRA4组小鼠的平均存活时间与PBS组、BCG空白菌组、BCG-空白载体组相比，免疫各组显著高于非免疫组(P＜0.05)，其中BCG-SAG2组小鼠的存活时间最长。