论文部分内容阅读
乳酸菌(LAB)能够产生具有抗菌活性的物质，能够抑制病原菌或腐败菌的生长。细菌素为这类抗菌活性的物质之一。细菌素是由某些细菌在代谢过程中通过核糖体合成产生的一类具有抑菌生物活性的蛋白质或多肽，其抑菌范围不局限于同源菌：而产生菌对其细菌素有自身免疫性。本文从干酪和酸奶中分离出产细菌素的乳酸菌，鉴定了产细菌素的乳酸菌的种类，研究了产细菌素的乳酸菌在体外和体内的抑菌谱，探讨了不同的培养条件对细菌素产生的影响，并对部分纯化所得的细菌素采用LC-MS对其进行鉴定。主要的研究结果如下：
1、用MRS和M17培养基从7种干酪和4种酸奶中总共分离出160株菌株；经革兰氏染色和过氧化氢酶检测，有138株具有革兰氏阳性和过氧化氢酶阴性的特征。采用琼脂糖扩散法对这138株菌株进行产细菌素的检测。用Listeriainnocua和Lactobacillussakei作为指示菌，发现28株菌株在MRS培养基中，37℃下培养16h后，去酸去过氧化氢后的无细胞上清液能够抑制L．innocua的生长；但其中只有20株能够抑制L.sakei的生长。
2、用α-胰凝乳蛋白酶、蛋白酶K和胰酶在37℃下作用于28株乳酸菌所产生的细菌素类似物2h后，这些细菌素类似物失去了它们抗L.innocua的能力，证明了它们的蛋白质特性。
3、克隆这28株乳酸菌16SrRNA片段，并对其进行分子鉴定。与NCBI数据库比对后结果为：28株乳酸菌中有24株属于Enterococcusfaecium，两株属于Streptococcusthermophilus．一株属于Lactobacillusparacaseisubsp.paracasei，另有一株为Lactobacilluscurvatus。
4、根据产细菌素的乳酸菌的种类、来源以及抑制L.innocua生长的抑菌圈大小，挑选出8株乳酸菌做进一步的研究。在热稳定性的研究中，发现在80℃下处理90min或在100℃下处理60min，所有细菌素类似物的抗菌活性都没有受到影响；而经121℃处理15min后，所有细菌素类似物的活性都有所降低，甚至有两株菌S.thermophilus(ASR-1)和L.paracaseisubsp,paracasei(JFR-5)所产生的细菌素类似物失去了它们的抗菌活性。
5、在对细菌素的体外抑菌谱的研究中，挑选出8株乳酸菌，测试它们在5℃和20℃下抑制L.innocua、Escherichiacoli、β.cereus、Pseudomonasfluorescens、Erwiniacarotovora,Leuconostocmesenteroidessubsp,mesenteroides、Penicilliumexpansum、Botrytiscinerea和Moniliniafrucitcola能力。乳酸菌代谢产生的酸和过氧化氢能够抑制除E.coli以外的其它病原菌或腐败菌的生长；而它们产生的细菌素对L.innocua有明显抑制作用。三种不同的乳酸菌Efaecium，S.thermophilus和L．paracaseisubsp,paracasei被分别添加到鲜切洋葱中，与对照相比，外源添加乳酸菌能够明显地抑制鲜切洋葱中自生菌和外源接种的Listeriasp.生长。
6、四株产细菌素的乳酸菌Aria-10(L．curvatus)、JFR-1（Efaecium）、JFR-5（L．paracaseisubsp,paracasei）和TSB-8（S.thermophilus）都能在20、37和43℃下生长（除了S.thermophilus菌株TSB-8不能在20℃生长外），但是培养温度越高，菌株的潜伏期越短。比较MRS和BHI两种培养基，发现乳酸菌菌株在BHI培养基中的潜伏期比在MRS培养基中短，但不论是温度，还是培养基都不影响乳酸菌的细胞产量；然而，乳酸菌细胞产量却受到培养基初始pH的显著影响(p<0.001)。在初始pH值为中性或弱碱性(pH6.2-8.5)的培养基中生长比在酸性(RH5.5、4.5)培养基中好(p<0.001)，四株乳酸菌都不能在初始pH为4.5的培养基中生长。
7、乳酸菌菌株在MRS培养基中培养比在BHI中培养能产生活性更高的细菌素(p<0.001)。相同培养基在相对初始pH值低的培养基(MRSpH6.2；BHIpH5.5)中，产生的细菌素活性更高。这四株乳酸菌最佳的产细菌素的生长条件是在MRS培养基上，初始pH为6.2，培养温度为37℃。
8、由JFR-1产生的细菌素在pH6.0时能100％地被JFR-1细胞吸附；两种Lactobacillusspp.(JFR-5和Aria-10)产生的细菌素在pH5.0时能100%地被它们的细胞所吸附；TSB-8(S.thermophilus）细胞对其产生的细菌素，在pH4.0有最大的吸收率。Tricine-SDS-PAGE检测结果显示，所有被检测的细菌素分子量都在4--6.5KDa之间，与其它报道的Enterococcus或Lactobacillus所产生的细菌素分子量大小范围类似。
9、用LC-MS检测出了具有抗菌活性的多肽片段。初始MS/MS数据通过NCBI数据库用MASCOT运算法则比对后，测试的9株乳酸菌所产生的细菌素，都能确定出至少1段有意义的多肽序列片段。