【摘 要】
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本文为建立简便、快速、灵敏、特异，且能满足现场检测的三唑磷免疫检测方法，开展了三唑磷半抗原、人工抗原合成及单克隆抗体制备研究，主要研究方法与结果如下： 首先，以三氯硫磷
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本文为建立简便、快速、灵敏、特异，且能满足现场检测的三唑磷免疫检测方法，开展了三唑磷半抗原、人工抗原合成及单克隆抗体制备研究，主要研究方法与结果如下：
首先，以三氯硫磷、无水乙醇、苯唑醇、巯基丙酸为主要原料，通过三步反应，合成三唑磷半抗原。然后，将三唑磷半抗原用活泼酯法和混合酸酐法与牛血清白蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)交联，得到免疫抗原和包被抗原。经紫外光谱分析，人工抗原TZPM-A-BSA、TZPM-M-BSA、TZPM-A-OVA、TZPM-M-OVA与载体BSA、OVA及半抗原的紫外光谱图相比均发生明显变化，四种人工抗原最大吸收峰的位置向远紫外区偏移，表明人工抗原合成成功。TNBS比色法进一步验证了人工抗原偶联成功，并测定出TZPM-A-BSA、TZPM-M-BSA、TZPM-A-OVA、TZPM-M-OVA四种人工抗原的偶联比，分别为 30：1、25：1、14：1、11：1。上述所有合成的人工抗原经分装后-20℃保存。
其次，采用合成的人工免疫原TZPM-A-BSA、TZPM-M-BSA分别免疫Balb/c小鼠，第3次免疫后从小鼠尾部取血制备抗血清。间接竞争ELISA法证明了血清中有特异性抗体的存在，TZPM-A-BSA、TZPM-M-BSA免疫小鼠新鲜抗血清效价分别为51200、25600。用TZPM-A-BSA免疫的小鼠中，2只小鼠产生了抗三唑磷的抗体，其中A1小鼠产生的抗体效价最高，达到51200，可用于细胞融合制备单克隆抗体。用TZPM-M-BSA免疫的小鼠中，2只小鼠产生了抗三唑磷的抗体，其中M1小鼠产生的抗体效价最高，达到25600，可用于细胞融合制备单克隆抗体。用A1小鼠的血清进行ELISA最佳条件研究，得出最佳反应条件：酶标二抗稀释倍数为1：10000；TZPM-A-OVA和TZPM-M-OVA包被抗原浓度均为1μg/mL；最佳竞争时间为1h。测定了抗血清的特异性，TZPM-A-BSA和TZPM-M-BSA免疫小鼠抗血清的IC<,50>分别为0.01μg/mL、0.5μg/mL。
最后，采用50％PEG将A1小鼠的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合，经多次筛选和克隆得到2株阳性杂交瘤细胞。2株细胞培养的上清液与BSA、OVA包被的酶标板反应呈阴性，与TZPM-A-OVA包被的酶标板反应呈阳性，间接竞争ELISA反应表明三唑磷与该上清液内的抗体进行特异性结合，因此，该2株细胞是预期的产抗三唑磷抗体的单克隆细胞株，分别命名为FC3、EB2，亚型分别属于IgM、IgG1。
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