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痛经是子宫腺肌病(adenomyosis,AM)常见的临床表现之一,严重影响了患者的日常生活和工作。子宫腺肌病的疼痛治疗及其机制的研究在临床上越来越受到重视。近年来不少的国内外研究发现神经生长因子(nerve growth factor, NGF)及其受体与AM痛经有极大的关系。“益坤抑痛平”作为许润三教授治疗子宫腺肌病经验方,在长期临床应用中发现对缓解AM导致的痛经有良好的疗效,因此本课题旨在以NGF受体为切入点,通过临床观察及动物实验证实“益坤抑痛平”缓解AM痛经的临床确切疗效及其作用机制。[目的]1.以子宫腺肌病痛经患者为研究对象,以“益坤抑痛平”颗粒为研究重点,以“安慰剂”为阴性对照,通过前瞻性、随机对照临床观察,客观评价“益坤抑痛平”颗粒治疗AM(肾虚血瘀证)的有效性和安全性。2.结合近年来国内外子宫腺肌病疼痛机制的最新研究,从神经致痛机制角度出发,以NGF受体P75为切入点,通过子宫腺肌病模型小鼠展开动物实验,探讨“益坤抑痛平”在缓解AM患者痛经的可能作用机制。[方法]1.临床研究前瞻性随机对照临床观察,采用“安慰剂”为对照药物,将肾虚血瘀型AM痛经患者进行随机分组观察方法,明确“益坤抑痛平”颗粒的临床有效性、安全性。(1)通过与对照组的比较分析,以VAS、COX为评分标准,对“益坤抑痛平”颗粒缓解肾虚血瘀型子宫腺肌病痛经程度及持续时间进行评价。(2)通过与对照组的比较分析,对“益坤抑痛平”颗粒改善肾虚血瘀型子宫腺肌病患者的中医证候积分、CA125及子宫大小等方面进行评价。(3)通过对治疗组和对照组患者治疗前后进行血、尿常规、肝肾功检测,评价“益坤抑痛平”颗粒的安全性。2.动物实验本研究以动物模型为实验对象,在细胞学和分子蛋白水平检测NGF及受体变化。实验共分为两个阶段,实验周期长达5个月,共分为3组,每组10只小鼠,分别为空白组,对照组和中药组。(1)第一阶段(造模阶段)：以口服他莫昔芬法建立ICR小鼠子宫腺肌病模型。将小鼠分为3组,对照组及中药组均口服他莫昔芬建立子宫腺肌病小鼠模型,空白组口服生理盐水。使用组织病理学方法显微镜下观察肌层是否出现内膜浸润,验证造模是否成功,以明确他莫昔芬法建立ICR小鼠子宫腺肌病模型的可行性。(2)第二阶段(动物实验阶段)：造模成功后,空白组和对照组小鼠均使用生理盐水灌胃,中药组小鼠使用“益坤抑痛平”颗粒灌胃干预。用药8周后处死小鼠,通过大体标本、子宫重量、组织病理学等方面观察三组小鼠用药前后的变化；采用实时荧光定量PCR、western blot方法检测三组小鼠子宫NGF及受体的表达差异,以探讨：①经益坤抑痛平及生理盐水灌胃后,中药组与对照组小鼠子宫大体标本、子宫重量及组织病理切片上有无异同。②子官腺肌病小鼠的病灶子宫中是否存在神经生长因子NGF及受体P75的异常高表达,并与正常小鼠的子宫进行对比分析。③经益坤抑痛平及生理盐水灌胃后,中药组与对照组小鼠子宫表达NGF及受体P75的异同。[结果]1.临床研究(1)经12周治疗后,通过VAS评分,治疗组和对照组的痛经评分均较疗前有下降(P<0.05)。而与对照组相比,治疗组疗后的痛经评分明显低于对照组(P<0.05),表明“益坤抑痛平”颗粒能明显缓解AM患者的痛经程度。(2)经过COX量表评分,与对照组相比,治疗组能明显缩短经行时下腹疼痛持续时间及其伴随症状发作的时间(P<0.05)。经过COX量表评分,与对照组相比,治疗组能明显缓解经行下腹疼痛程度及伴随症状程度(P<0.05)。表明“益坤抑痛平”颗粒能明显缓解痛经持续的时间及程度。(3)治疗12周后,治疗组与对照组的中医证候积分均比疗前有下降(P<0.05)。且治疗组疗后的中医评候积分明显低于对照组,表明与安慰剂相比,“益坤抑痛平”颗粒在缓解AM患者的中医证候方面有明显的作用。(4)治疗12周后,治疗组与对照组在治疗前后子宫大小上均无明显变化(P>0.05)。表明“益坤抑痛平”颗粒对改善AM患者的子宫大小方面,无明显作用。(5)治疗12周后,治疗组与对照组在治疗前后的血清CA125值均无明显变化(P>0.05)。表明“益坤抑痛平”颗粒对降低AM患者的血清CA125无明显作用。(6)治疗组在用药期间未发现明显不良反应,治疗前后血常规、尿常规、肝肾功检查均未见异常。2.动物实验(1)造模结果：口服他莫昔芬3月后,分别处死造模组及空白组小鼠各1只,观察大体标本及病理组织切片。①从大体标本上看,造模组小鼠子宫比正常组小鼠子宫增大,表面可见少量腺肌病结节。②从小鼠子宫切片上看,造模组小鼠子宫内膜层结构紊乱,与子宫肌层无明显分界线,子宫肌层可见腺体细胞及间质细胞。(2)动物实验结果①中药组与对照组小鼠相比,子宫仍呈增大趋势,且子宫表面可见腺肌病结节。表明益坤抑痛平对子宫腺肌病小鼠的子宫形态无明显作用。②经中药灌胃8周后,中药组与对照组小鼠子宫重量无明显差异(P>0.05)。表明益坤抑痛平对子宫腺肌病小鼠的子宫重量无明显影响。③经中药灌胃8周后,子宫腺肌病小鼠子宫切片仍显示肌层有明显的腺体及间质细胞学好润,只是浸润情况对照组较中药组更为紊乱。表明益坤抑痛平并未能缓解腺体及间质细胞对肌层的浸润情况,但似乎可以延缓腺体及间质细胞的浸润速度。④灌胃8周,通过实时荧光定量PCR及western b lot分析,三组小鼠NGF的mRNA和蛋白表达无明显差异(P>0.05)。⑤灌胃8周,通过实时荧光定量PCR及western blot分析,子宫腺肌病模型小鼠子宫P75的mRNA及蛋白表达比空白组呈上升趋势(P<0.05),经中药治疗后又呈下降趋势(P<0.05)。[结论]1.临床观察(1)“益坤抑痛平”颗粒可明显缓解AM患者痛经的程度及持续时间,亦可明显改善AM患者的中医证候。(2)“益坤抑痛平”颗粒对改善AM患者的子宫大小及降低血清CA125值,无明显作用。(3)“益坤抑痛平”在治疗过程中患者未出现明显不良反应,表明此药物有一定的安全性。2.动物实验(1)口服他莫昔芬法进行子宫腺肌病小鼠造模方法有效、可行。(2)益坤抑痛平对改善子宫腺肌病小鼠子宫的形态、重量方面无明显作用。(3)益坤抑痛平虽不能改善腺体及间质细胞对肌层的浸润,但似乎可以延缓腺体及间质细胞的浸润速度。(4)在子宫腺肌病小鼠的子宫中,并未见到NGF的高表达；中药灌胃后NGF也无明显变化。(5)在子宫腺肌病小鼠的子宫中,P75有高表达,经过益坤抑痛平治疗后,其表达明显降低。表明益坤抑痛平可能通过作用在NGF的受体P75上来达到缓解子宫腺肌病痛经的作用。