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我国是世界上竹类资源最丰富的国家,毛竹是竹类资源中最主要且应用最广泛的造林、造纸竹种,因具有速生、纤维素含量高等特点,成为优良的纸浆原材料。由于其独特的生物学特性,传统育种手段的应用受到严重制约。竹材的固有缺陷制约了竹板材加工的高速发展,竹纤维原料匮乏制约了竹浆造纸业的规模化发展。如何定向改良现有的毛竹材性,培育满足我国日益增长的工业化利用所需的多功能、多用途、高性能、高附加值的专用竹材新品种,已成为当前竹类植物遗传育种的首要任务。因此,利用生物技术等手段改变木质素含量或改变其制浆性能,创造出符合制浆造纸原料特性要求和适用于板材加工的竹材新品种,对于竹林培育和竹材工业化利用的技术进步具有重要意义。PAL是木质素生物合成途径的核心酶之一,位于苯丙烷代谢途径的入口;CCoAOMT和CAD是两种位于木质素特异合成途径下游的酶类,对于木质素合成调控也具有重要作用。本文主要在毛竹木质素生物合成酶相关基因PAL、CCoAOMT和CAD的克隆、表达鉴定以及其烟草转化等方面展开研究工作,具体研究内容如下:(1)本研究利用改良的CTAB法和Trizol法提取毛竹的DNA和RNA,质量较好,纯度高,可以用作进一步的分子生物学研究。(2)本研究利用Genome walking法克隆得到毛竹PAL基因的DNA序列,长2 736 bp,基因含有一个内含子和一个预测的启动子序列。推测的毛竹PAL基因DNA序列编码区编码712个氨基酸,分子量约为77 KD。与己知的禾本科植物绿竹、水稻的PAL基因氨基酸序列相似性分别达到95%、94%。(3)本研究利用RT-PCR和RACE法获得了毛竹PAL基因全长cDNA(命名为PAL1),全长共2 678bp,开放阅读框架(ORF)2 142bp,编码713个氨基酸,分子量约为77 KD,与禾本科植物水稻、绿竹的PAL基因有90%以上的相似性。组织特异性表达表明,PAL1在毛竹根、茎、叶和幼苗中都有表达,但表达量存在较明显差异,根中表达量最高。(4)分别获得了长度为787 bp和1 019 bp的CCoAOMT和CAD基因片段。编码区分别编码197、282个氨基酸,与水稻、玉米、梯牧草等植物的CCoAOMT、CAD基因均具有90%以上的相似性,GenBank登录号分别为EF549579、EF549577。(5)构建了毛竹PAL1基因的原核表达载体pET16b-PAL1,在大肠杆菌BL21中诱导表达后纯化出目的蛋白。以L-苯丙氨酸为底物,测定Km值为(0.421±0.023 )×10-3mol/L;最适反应温度是50℃;最适反应pH值为8.8。(6)构建了毛竹PAL1、CCoAOMT和CAD基因正反义植物表达载体pBI121-PAL1、pBI121-anti PAL1、pBI121-anti CCoAOMT和pBI121-anti CAD,转化农杆菌后通过叶盘法侵染烟草,经过愈伤组织继代培养得到植株幼苗。经PCR初步检测,得到转基因植株,为进一步的研究奠定了基础。