论文部分内容阅读
第一部分:IV型胶原酶抑制剂的筛选研究基质金属蛋白酶(Matrix metalloproteinase,MMP)是锌肽酶家族的一员,广泛分布于植物、脊椎动物、无脊椎动物中,是组成结缔组织的细胞外基质降解过程中必不可少的酶,几乎能降解细胞外基质的所有成分.在体内的多种生理和病理过程中起重要作用.尤其是基质金属蛋白酶在肿瘤的生长、转移和血管生成等多个环节中发挥着重要作用,因此成为肿瘤治疗研究中引人注目的新靶点.研究表明,MMP<,s>的组织特异性抑制剂TIMP<,s>或合成的小分子MMP抑制剂(MMPI<,s>)可以抑制肿瘤的生长和转移.基质金属蛋白酶家族中尤以Ⅳ型胶原酶最为重要,由于Ⅳ型胶原是细胞外基质的主要结构蛋白,而Ⅳ型胶原酶是唯一能降解Ⅳ型胶原三螺旋部位的酶,所以Ⅳ型胶原酶在肿瘤侵袭转移中占重要地位<[7]>.所以,现今的主要目的是寻找Ⅳ型胶原酶的特异性抑制剂.以现有的Ⅳ型胶原酶抑制剂筛选模型来筛选微生物发酵液和化合物.共筛选发酵液3600株,化合物800个.经过反复筛选,共得到6个化合物以及发酵液1340和1377,有明显的抑制作用.对化合物进行了明胶酶谱实验,并对1377进行了初步的研究.第二部分:以ABCA1为靶点的药物筛选模型的初步建立 从外周流向肝脏的胆固醇逆转运过程,会使泡沫细胞中过量的胆固醇外流并被肝脏细胞利用.有利于清除多余胆固醇,防止动脉粥样硬化的发生.实验证明:胆固醇逆向运输机制的增强有可能使动脉粥样硬化损伤发生逆转甚至消退.在此过程中起重要作用的ABCA1蛋白逐渐引起人们的重视,它已经成为治疗动脉粥样硬化心血管疾病的新的靶点,能提高ABCA1基因表达的化合物很有可能成为有效治疗动脉粥样硬化的新药.为此构建了ABCA1表达上调剂的高通量初步筛选模型.期望通过对微生物发酵液及化合物的筛选能得到有意义的结果,从而发展成新药.以肝癌细胞系Bel-7402细胞总DNA为模板,用PCR的方法扩增ABCA1基因上游调控序列(942bp).将得到的片断用T-easy载体克隆并测序,并将其克隆到pGL-basic的多克隆位点处,使之位于荧光素酶报告基因编码序列的上游,构建成重组质粒.用不含启动子序列的阴性对照质粒pGL-basic、含有SV40启动子和增强子的阳性对照质粒pGL-control和构建的重组质粒分别瞬时转染肝癌Bel-7402细胞,构建了ABCA1表达上调剂的初步筛选模型.