论文部分内容阅读
MicroRNA（miRNA）是一类长约19-22个核苷酸的内源性非编码小RNA，在生物体内发挥着重要的调节作用。家蚕是一种重要的鳞翅目模式生物，家蚕丝腺具有高效、特异地合成丝蛋白的能力，具有重要的经济价值。为了研究家蚕miRNAs对丝素蛋白基因表达的调控作用，国内外很多科研机构开展了家蚕 miRNA的研究，取得了许多重要进展。本文在家蚕后部丝腺 miRNA高通量测序的基础上，继续筛选对丝素基因BmFib-L和BmP25基因表达具有调控作用的miRNAs，并进行实验验证。主要研究结果如下。 1. Bmo-miR-375*和bmo-miR-2755*在BmFib-L、BmP25 mRNA的3′UTR都有潜在的靶位点。 采用生物信息学方法筛选获得对家蚕丝素轻链基因（BmFib-L）和 P25蛋白基因（BmP25）有潜在调控作用的miRNAs。应用靶基因预测软件预测与BmFib-L3′UTR和 BmP253′UTR作用的 miRNA分子，选择靶基因预测有靶位点且表达差异大的miRNAs，共获得可能参与调控BmFib-L和BmP25基因的2个miRNAs（miR-375*、miR-2755*）。 2. Bmo-miR-375*和bmo-miR-2755*存在调控BmFib-L和BmP25基因表达的时空条件。 利用RT-PCR技术分析bmo-miR-2755*、bmo-miR-375*及其靶基因BmFib-L和BmP25在家蚕幼虫4-5龄期后部丝腺和5龄3d不同组织中的表达水平。提取家蚕幼虫4-5龄后部丝腺和5龄3d不同组织的总RNA进行bmo-miR-375*、bmo-miR-2755*、BmFib-L和BmP25的反转录合成cDNA，以cDNA为模板进行PCR。结果显示四者在后部丝腺中的表达水平都较高,表明 bmo-miR-375*和 bmo-miR-2755*具有调控BmFib-L和BmP25表达的时空条件。 3. Bmo-miR-2755*在BmN细胞中显著下调BmFib-L基因的表达而上调BmP25基因的表达。 我们以 pcDNA3为载体，构建 bmo-miR-2755*表达载体pcDNA3[ie1-egfp-pri-miR-2755*-SV40]；以 pGL3.0-Basic为载体，分别构建 BmFib-L3′UTR、BmP253′UTR与报告基因 luc的融合报告质粒 pGL3.0[A3-luc-Fib-L-3′UTR-SV40]和 pGL3.0[A3-luc-P25-3′UTR-SV40]。再以海肾荧光素酶表达载体pRL-CMV为内参，用bmo-miR-2755*表达载体和报告质粒共转染BmN细胞，检测报告基因luc的表达水平。结果表明bmo-miR-2755*显著下调BmFib-L基因的表达；对BmP25基因的表达则有上调作用，但是调控作用未达显著水平。 4. Bmo-miR-375*在BmN细胞中显著抑制BmFib-L基因的表达而对BmP25基因表达无明显的调控作用。 构建真核 miRNA表达载体，以 pcDNA3为载体，构建 bmo-miR-375*表达载体pcDNA3[ie1-egfp-pri-miR-375*-SV40]；以 pGL3.0-Basic为载体，分别构建 BmFib-L3′UTR、BmP253′UTR与报告基因 luc的融合报告质粒 pGL3.0[A3-luc-Fib-L-3′UTR-SV40]和 pGL3.0[A3-luc-P25-3′UTR-SV40]。再以海肾荧光素酶表达载体pRL-CMV为内参， Bmo-miR-375*表达载体和报告质粒共转染BmN细胞，检测报告基因luc的表达水平。结果表明bmo-miR-375*显著下调BmFib-L基因的表达，而对BmP25基因调控作用并不显著。