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目的肝癌（Hepatocellularcarcinoma,HCC）是一种发病率高和死亡率高的癌症疾病,在全球发病率中排第六,死亡率位居全球第四,严重威胁人类的健康。目前针对肝癌一般采用手术切除、局部消融、肝移植、化疗、放疗和靶向药物治疗等方式,但效果并不理想,肝癌患者的总体生存率仍然很低。因为免疫系统可以识别并清除肿瘤微环境中的肿瘤细胞,在抗肿瘤过程中发挥着非常重要的作用,因此,基于增强免疫系统功能的治疗方法已经成为了近些年的研究热点,有效提高了肝癌的临床治疗效果。然而,在临床治疗中,经过免疫治疗的肝癌患者会产生耐药性,严重降低了治疗效果。这是因为肿瘤在发生发展过程中,可以通过形成免疫抑制环境、降低免疫原性以及高表达原癌基因等方式逃逸免疫系统的免疫监视作用。因此,阐明肿瘤细胞发生免疫逃逸的机制非常重要。目前认为,在免疫系统抗肿瘤的过程中,免疫系统对肿瘤具有重塑作用,即肿瘤细胞在免疫系统的免疫压力下,降低自身的免疫原性以逃逸免疫系统的监视作用并进一步生长,这一过程被称为“免疫编辑”。同时,肿瘤细胞通过“反向免疫编辑”的过程塑造免疫系统。自然杀伤细胞（Naturalkiller,NK）是天然免疫系统的重要组成部分,是机体抵御外来的病原体和肿瘤细胞的第一道防线。NK细胞能够在没有预先刺激的情况下,直接而快速地发挥免疫清除和免疫监视功能,靶向清除病原体感染的细胞或者恶性转化的细胞。NK细胞快速识别和杀死肿瘤细胞的独特特性,主要取决于NK细胞表面活化性和抑制性受体识别靶细胞上相应的配体后,通过相互作用整合所传递的信号的平衡状态。NK细胞表面表达多种活化性受体,其中NKG2D、自然细胞毒性受体（Natural cytotoxicity receptors,NCRs）、CD226 等是目前公认的在NK细胞抗肿瘤免疫应答中发挥关键作用的活化受体。NK细胞通过这些活化性受体识别肿瘤细胞上相应的配体促进自身的活化,从而在抗肿瘤过程中发挥重要的作用。NCRs主要包括NCR1（NKp46）、NCR2（NKp44）和NCR3（NKp30）,NCR1在所有NK细胞上表达,是唯一与小鼠有同源基因的NCR。NCR1可以识别流感血凝素和未知的肿瘤配体传递活化信号,通过分泌穿孔素等细胞毒性物质直接介导NK细胞毒活性,同时也促进NK细胞分泌IFN-γ等细胞因子。因此,NCR1在NK细胞抵抗外来病毒感染和抗肿瘤过程中发挥着重要的作用,NK细胞可以通过NCR1对病毒感染的细胞或肿瘤细胞产生免疫压力。已有研究证明,NK细胞对肿瘤细胞具有免疫编辑作用。在NK细胞的免疫压力下,肿瘤细胞通过降低NKG2D配体和NCR1配体等活化性受体的配体水平,以降低NK细胞的识别和杀伤能力。近年来,已经发现NCR1对黑色素瘤、纤维肉瘤、淋巴瘤等有免疫编辑作用,然而NCR1在肝癌的发生发展中作用尚不清楚。在本研究中,我们通过体内体外实验验证了 NK细胞是否可以通过NCR1受体识别肝癌细胞NCR1配体,促进活化,增强对肿瘤细胞的杀伤能力。随后通过检测野生鼠（wide type,WT）和NCR1缺失小鼠来源的肿瘤细胞NCR1配体的表达水平,观察在NCR1的免疫压力下,肝癌细胞是否降低NCR1配体的表达水平以逃逸NK细胞的识别和杀伤。同时将两种小鼠来源的肝癌细胞接种到WT小鼠中,观察其免疫原性是否有差异、肝癌细胞免疫原性的改变是否影响NK细胞的活化功能。以期为肝癌逃逸NK细胞的免疫监视作用阐明新的机制,为肝癌的免疫治疗提供新的启示。为了提高机体免疫系统的活化功能,我们设计合成了以GPC-3为靶点的3p-GPC-3 siRNA。通过体内体外实验验证3p-GPC-3 siRNA是否既可以通过特异性沉默GPC-3的表达直接抑制肝癌细胞的增殖,又可以激活固有免疫相关信号通路,从而有效提高机体免疫系统的活化和抗肿瘤功能。另外,在肝癌发生免疫逃逸的过程中形成的免疫抑制环境也会降低免疫系统的应答能力,严重影响免疫治疗效果。因此,我们将3p-GPC-3 siRNA联合anti-PD-1抗体治疗进行肝癌的实验治疗,以期进一步增强免疫系统的活化,逆转肿瘤免疫微环境的免疫抑制状态,改善免疫记忆,达到更好的抗肿瘤效果,为肝癌的免疫治疗提供新的策略。方法一、NCR1对肝癌的免疫编辑作用1.分别以NCR1缺失小鼠和WT小鼠建立皮下荷瘤、原位荷瘤和DEN诱导HCC模型,观察肿瘤的生长情况。2.分离NCR1缺失小鼠和WT小鼠脾脏中的NK细胞,并分别和Hepa1-6细胞、Yac-1细胞和Hela细胞进行体外共培养,利用LDH试剂盒检测NK细胞对肿瘤细胞的杀伤效率。3.通过流式细胞术检测NCR1缺失小鼠和WT小鼠肝脏、脾脏及肿瘤浸润及的NK细胞比例、NK细胞相关受体的表达以及分泌IFN-γ的水平。4.利用免疫组织化学法和Western blotting检测三种肝癌荷瘤模型中NCR1缺失小鼠和WT小鼠来源的肿瘤细胞NCR1配体的表达水平。5.通过流式细胞术检测三种肝癌荷瘤模型中NCR1缺失小鼠和WT小鼠来源的肿瘤细胞NCR1配体、Qa1、NKG2D配体、CD48、及H-2Kd/H-2Dd的表达水平。6.免疫荧光法检测肿瘤细胞Ki67的表达;通过流式细胞术和Annexin V-PI细胞凋亡检测试剂盒检测肿瘤细胞的凋亡水平;通过Western blotting检测肿瘤细胞 PCNA、Bax、Bcl-2、Bcl-XL、Caspase-3、p21、p27、Cyclin B1和 CyclinD1的表达水平。7.将高表达NCR1配体和低表达NCR1配体的肝癌细胞进行体外培养,然后分别皮下接种到NCR1缺失小鼠和WT小鼠体内,观察各组小鼠肿瘤的生长情况。通过流式细胞术检测肿瘤浸润及脾脏的CD4+T细胞、CD8+T细胞和NK细胞比例、细胞相关受体的表达以及分泌IFN-γ的水平。8.通过腹腔注射anti-NK1.1单克隆抗体清除小鼠体内NK细胞,然后将高表达NCR1配体的肝癌细胞皮下接种至小鼠体内,观察肿瘤的生长情况,最后通过流式细胞术检测肿瘤浸润及脾脏的CD4+T细胞和CD8+T细胞的比例及活化情况。二、3p-GPC-3 siRNA联合PD-1阻断治疗肝癌的作用研究1.通过荧光定量PCR检测Hepa 1-6细胞GPC-3、RIG-Ⅰ和型干扰素的mRNA水平。2.通过 Western blotting 检测 Hepa 1-6 细胞 GPC-3、Bax、Bcl-2、Bcl-XL 和Caspase-3的表达水平。3.通过酶联免疫吸附试剂盒分别检测Hepa 1-6细胞上清及小鼠血清中的Ⅰ型干扰素的水平,以及肿瘤匀浆液和血清中TGF-β和IL-10的水平。4.通过Annexin V-PI细胞凋亡检测试剂盒检测Hepa 1-6细胞的凋亡水平,通过TUNEL一步法检测肿瘤组织的凋亡水平。5.通过免疫荧光法检测Hepa 1-6细胞Ki67的表达。6.通过皮下注射Hepa 1-6细胞或Hepa 1-6-GFP-luc+细胞,建立皮下荷瘤模型,然后进行瘤内注射3p-GPC-3 siRNA或腹腔注射anti-PD-1抗体治疗,观察各组小鼠体内肿瘤生长情况。7.通过流式细胞术检测小鼠肿瘤浸润的以及脾脏CD4+T细胞、CD8+T细胞、NK细胞、Treg细胞和MDSC的比例及CD4+T细胞、CD8+T细胞和NK细胞的活化情况。8.通过腹腔注射anti-CD4、anti-CD8及anti-NK1.1单克隆抗体,分别清除小鼠体内CD4+T细胞、CD8+T细胞及NK细胞,同时给予3p-GPC-3 siRNA治疗,观察小鼠肿瘤的生长情况。9.通过流式细胞术检测小鼠肝癌细胞PD-L1的表达水平及肿瘤浸润的CD8+T细胞和NK细胞表达PD-1的水平。10.通过流式细胞术检测肿瘤浸润以及脾内CD8+T细胞和NK细胞上PD-1、CD160和Lag3等免疫检查点分子的表达。11.通过流式细胞术检测肿瘤浸润以及脾内TCM和TEM的比例及细胞上CD127和KLRG1的表达水平。结果一、NCR1对肝癌的免疫编辑作用1.NCR1在肝癌发生发展过程中发挥重要的作用在皮下荷瘤、原位荷瘤及DEN诱导肝癌模型中,与WT小鼠相比,NCR1缺失小鼠体内肿瘤生长更快,肿瘤体积更大。提示NCR1在机体抗肿瘤过程中发挥关键作用。2.NCR1缺失肝癌模型小鼠NK细胞具有较低的活化和抗肿瘤活性在皮下荷瘤、原位荷瘤及DEN诱导肝癌模型中,与WT小鼠相比,NCR1缺失小鼠肿瘤浸润和脾脏中的NK细胞表达CD69的水平较低,同时低表达活化性受体NKG2D,高表达抑制性受体CD96,IFN-γ的分泌水平较低,对Hepa 1-6细胞的杀伤效率较低。表明NCR1缺失肝癌模型小鼠的NK细胞具有较低的活化水平和抗肿瘤能力。3.NCR1缺失不影响非荷瘤小鼠的NK细胞活化与功能在非荷瘤的状态下,NCR1缺失小鼠和WT小鼠的肝脏和脾脏中NK细胞比例、NKG2D、DNAM1、CD96、NKG2A、Ly49F、NKG2A/C/E和Ly49C/I/F/H 等受体的表达以及活化水平均没有差异。说明NCR1的表达对于NK细胞的正常表型发育不是必需的,在非荷瘤小鼠中,NCR1的缺失没有直接影响NK细胞的活化水平。4.NK细胞NCR1对肝癌细胞具有免疫编辑作用在皮下荷瘤、原位荷瘤及DEN诱导肝癌模型中,WT小鼠来源的肝癌细胞上NCR1配体的表达水平明显降低,但是NCR1配体在NCR1缺失小鼠来源的肝癌细胞上的表达保持较高水平。其他配体的表达水平（包括Qa1、NKG2DL、CD48和H-2Kd/H-2Dd）没有差异。但是当体内清除NK细胞后,则两种小鼠体内肝癌细胞NCR1配体的表达没有差异。结果说明,在肝癌生长过程中,在NCR1存在的免疫压力下,肝癌细胞可能通过降低NCR1配体的表达来逃逸NK细胞的识别,即发生了免疫编辑过程。另外,将两种肝癌细胞接种到WT小鼠体内,则发现经过NCR1免疫编辑的肝癌细胞生长更快,说明经过NCR1免疫编辑的肝癌细胞的免疫原性降低。接下来,我们检测了 NK细胞的活化情况,发现经过NCR1免疫编辑的肝癌模型小鼠体内,NK细胞的活化水平降低,主要表现为CD69的表达水平较低,IFN-γ的分泌水平较低,同时低表达NKG2D、高表达CD96。结果提示,肝癌细胞会通过降低免疫原性而降低NK细胞对自身的杀伤敏感性,从而逃逸NK细胞的攻击。5.经过NCR1免疫编辑的肝癌模型小鼠体内CD8+T细胞的活化和功能呈低下状态将未经过NCR1免疫编辑和经过NCR1免疫编辑的肝癌细胞接种到WT小鼠体内,与未经过NCR1免疫编辑的肝癌细胞相比,经过NCR1免疫编辑的肝癌细胞组中,肿瘤浸润和脾脏中的CD8+T细胞活化水平较低,且CD8+T细胞表达CD69的水平及分泌的IFN-γ水平均较低。当NK细胞被清除后,CD8+T细胞表达CD69的水平及分泌的IFN-丫水平明显下降。说明在NCR1介导肝癌细胞发生免疫编辑的过程中,CD8+T细胞的活化水平也受到影响,这种影响是依赖于NK细胞的。6.经过NCR1免疫编辑的肝癌细胞本身的生物学特性亦发生变化与未经过NCR1免疫编辑的肝癌细胞相比,经过NCR1免疫编辑的肝癌细胞体外增殖能力更强,高表达与增殖能力相关的Ki67和PCNA,且低表达抑制细胞周期蛋白p21和p27,高表达细胞周期蛋白Cyclin B1和Cyclin D1。但是,两种肝癌细胞的凋亡水平没有差异。二、3p-GPC-3 siRNA联合PD-1阻断治疗肝癌的作用研究1.肝癌细胞高表达GPC-3在小鼠胚胎肝细胞BNL CL.2细胞系和小鼠正常肝组织中几乎不表达GPC-3,而在肝癌细胞系Hepa1-6和肝癌组织中明显高表达。结果说明GPC-3在肝癌组织中异常高表达,可能对肝癌的发生发展起着重要的促进作用。2.3p-GPC-3 siRNA的功能验证当 Hpea 1-6 细胞转染 3p-GPC-3 siRNA 后,Hepa 1-6 细胞 GPC-3 的 mRNA水平和蛋白质水平显著降低,且细胞内RIG-I、IFN-α和IFN-β的mRNA水平明显升高。此外,Hepa 1-6细胞分泌的IFN-α和IFN-β的水平也升高。3.3p-GPC-3 siRNA可抑制肿瘤的生长通过体内和体外实验发现,3p-GPC-3 siRNA可抑制Hepa 1-6细胞的增殖,且肿瘤细胞发生明显的凋亡,同时小鼠血清中Ⅰ型干扰素的分泌水平升高。结果提示,3p-GPC-3 siRNA一方面可通过沉默Hepa 1-6细胞GPC-3的表达促进细胞凋亡,抑制细胞增殖,另一方面通过刺激Ⅰ型干扰素的产生,从而在体内体外发挥抗肿瘤作用。4.3p-GPC-3 siRNA可活化T细胞和NK细胞用3p-GPC-3 siRNA治疗后,小鼠肿瘤组织和脾脏中CD4+T细胞、CD8+T细胞和NK细胞的比例和活化功能均显著增加。同时,肿瘤浸润的Treg数量减少。这些结果表明,3p-GPC-3 siRNA可以通过增强全身系统和局部肿瘤组织中免疫系统的活化发挥抗肿瘤作用。5.CD8+T细胞和NK细胞在3p-GPC-3 siRNA的抗肿瘤过程中发挥了重要作用清除CD4+T细胞后,并没有影响3p-GPC-3 siRNA的治疗效果。然而,NK和CD8+T细胞的缺失显著降低了 3p-GPC-3 siRNA的抗肿瘤效果,说明CD8+细胞和NK细胞在3p-GPC-3 siRNA的抗肿瘤过程中均有重要的作用。6.肿瘤微环境中CD8+T细胞和NK细胞表达高水平的PD-1肿瘤浸润的CD8+T和NK细胞上表达较高水平的PD-1,这提示可以通过联合PD-1阻断剂进行治疗,以进一步提高3p-GPC-3 siRNA的治疗效果。7.联合anti-PD-1抗体可有效提高3p-GPC-3 siRNA的治疗效果3p-GPC-3 siRNA和anti-PD-1抗体联合治疗可以最显著地抑制肿瘤生长,联合治疗组小鼠的肿瘤比单治疗组小,且生长更慢。此外,联合治疗组的小鼠生存时间最长。通过这些结果可以确定,联合anti-PD-1抗体可进一步提高3p-GPC-3 siRNA的抗肿瘤作用。8.联合治疗可进一步增强CD8+T和NK细胞的活化功能联合治疗后,小鼠肿瘤浸润和脾内CD8+T和NK细胞的比例及活化功能进一步升高。同时在联合治疗组中,小鼠肿瘤浸润和脾内CD8+T和NK细胞抑制性受体表达最低,且小鼠肿瘤组织匀浆液和血清中TGF-β的浓度也最低。这些结果提示,联合anti-PD-1抗体治疗可通过进一步活化CD8+T细胞和NK细胞,并在肿瘤局部和全身免疫系统中逆转免疫耗竭,最终增强免疫系统的免疫应答,促进3p-GPC-3 siRNA的抗肿瘤作用。9.联合治疗可产生更有效的抗肿瘤免疫记忆反应联合治疗可有效提高肿瘤浸润和脾内TCM细胞和TEM细胞的比例,而且在联合治疗组中,TCM细胞亚群表达CD127的水平和TEM细胞表达KLRG1的水平最高。结果表明,联合anti-PD-1抗体可通过进一步增加免疫记忆细胞的比例,提高CD127或KLRG1在TCM细胞或TEM细胞亚群中的表达水平,增强3p-GPC-3 siRNA治疗后产生的免疫记忆反应。结论及意义一、NCR1对肝癌的免疫编辑作用1.本研究首次发现NCR1对肝癌发挥免疫编辑作用。在NK细胞NCR1的选择性压力下,肝癌细胞通过降低NCR1配体的表达逃逸NK细胞识别和杀伤。这种NK细胞抗肿瘤能力的降低会进而影响CD8+T细胞的活化与功能,进一步促进肝癌的免疫逃逸。2.本研究阐明了肝癌逃逸NK细胞的免疫监视作用的新机制,将为肝癌的免疫治疗提供新的启示。二、3p-GPC-3 siRNA联合PD-1阻断治疗肝癌的作用研究1.本研究首次确定了联合3p-GPC-3 siRNA和PD-1阻断性抗体可以有效治疗肝癌。2.本研究阐明了 3p-GPC-3 siRNA联合PD-1阻断发挥抗肿瘤作用的机制:3p-GPC-3 siRNA可以通过靶向沉默肝癌细胞GPC-3直接抑制肿瘤细胞的增殖,还可以通过诱导活化RIG-Ⅰ信号通路,促进固有免疫应答。当联合PD-1阻断时,可通过进一步增强适应性免疫系统的活化,同时逆转免疫细胞耗竭,全面激活免疫系统,从而发挥有效的抗肿瘤作用。3.本研究首次发现3p-GPC-3 siRNA联合PD-1阻断治疗肝癌时,可以有效唤起小鼠体内的免疫记忆。4.本研究为肝癌治疗提供了新的思路和策略。