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角膜病是当前致盲的主要眼病之一,在我国是继白内障疾病之后的第二大致盲眼病,约占15.4%。目前绝大多数严重威胁人类健康的疾病如糖尿病、高血压、冠状动脉疾病和精神分裂症,还包括儿童先天性缺陷如唇裂、鄂裂及许多先天性心脏病也都受到多基因的调控。本实验室采用ENU化学诱变的方法获得一种角膜混浊表型的小鼠模型,将其主基因鉴定为RAX并将该小鼠命名为RAX突变小鼠。本文是对RAX突变小鼠角膜特点及其修饰基因进行研究,主要分为以下三个方面:1、RAX无义突变小鼠角膜特点的研究本文以RAX无义突变小鼠为研究对象,将该小鼠与正常B6小鼠繁殖,筛选具有角膜混浊表型的杂合子小鼠。对角膜混浊小鼠眼球进行组织学分析发现,突变小鼠角膜基质层及角膜层明显变薄,且角膜表层细胞呈水泡样。再采用免疫组织化学的方法对该8W以上小鼠进行蛋白分子分析,结果显示突变小鼠角膜蛋白Cytokeratin 12(K12)、Cytokeratin 14(K14)、Cytokeratin13(K13)及 PAX6 均发生了变化。2、角膜混浊修饰基因的定位采用将B6背景角膜混浊杂合子小鼠与D2小鼠配种获得F1代小鼠,F1代小鼠继续回交B6获得[(B6×D2)B6]N2代的方案获得角膜混浊杂合子。筛选突变杂合子N2代小鼠1782只,其中180只小鼠表现有角膜混浊表型,通过基因连锁分析结果修饰基因与微卫星D1Mit145连锁(LOD值5.97),初步将该基因定位于小鼠第1号染色体上。为对该修饰基因进行精确定位,在1号染色体上增加微卫星密度,最终将该修饰基因定位于1号染色体 68.38cM-74.68cM 之内。3、角膜混浊修饰基因的鉴定根据定位结果,通过MGI数据库查询该小鼠修饰基因定位区域附近相关基因,并对相关基因进行基因功能分析,最终初步将候选基因确定为:Pou2f1。继而对候选目的基因设计引物,分别PCR扩增候选目的基因,切胶回收后测序,将以上测序结果与本实验中心野生型B6小鼠、D2小鼠基因序列进行对比,筛查突变位点。Pou2f1启动子部分三段引物分别为 Pou2f1717、Pou2f1736、Pou2f1703;Pou2f1 编码区部分三段引物分别为 Pou2f1910、Pou2f11029、Pou2f1556。双向测序结果显示突变小鼠Pou2f1在基因编码区未发现重叠峰而在启动子区域发现多个单核苷酸多态性。