论文部分内容阅读
目的:缺血性脑血管病患病率、致残率和病死率高,是临床上常见的危害人类健康的三大疾病之一。缺血后继发的脑组织损伤是病情加重及影响患者预后的重要原因。近年来,虽然对脑缺血后脑损伤的病理生理机制的研究取得重大进步,但是临床治疗策略的选择仍然有限。急性期溶栓治疗是目前公认的治疗脑梗塞最有效的方法,可以极大程度的改善患者的预后。然而有限的溶栓治疗时间窗,梗塞后再出血及缺血后再灌注损伤等并发症的存在限制了溶栓治疗的临床应用。炎症反应和氧化应激是缺血后脑损伤的两大病理生理机制,脑缺血后,炎症因子表达、氧化应激相关基因表达上调,为临床治疗提供了新的靶点。花生四烯酸(Arachidonic acid, AA)代谢通路是经典的致炎、氧化应激反应通路之一。12/15-脂氧合酶( 12/15-lipoxygenase, 12/15-LOX )介导的丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信号通路,是AA的主要代谢通路之一,能催化AA产生羟基二十碳四烯酸、白三烯等生物活性物质,参与缺血后脑损伤的病理生理过程。阿托伐他汀(atorvastatin)是临床常用的他汀类降脂药,除能调节血脂外,还有抗炎、抗氧化以及减轻细胞毒性反应等作用。动物实验研究表明阿托伐他汀预处理可以减轻脑梗塞体积,改善神经功能评分。临床观察发现长期应用阿托伐他汀可以促进脑梗塞患者神经功能恢复。但有关阿托伐他汀在脑梗塞急性期的保护作用及机制的研究甚少。本实验在大鼠永久性大脑中动脉闭塞(permanent middle cerebral artery occlusion,MCAO)所致脑缺血模型上观察局部脑缺血后大脑皮层12/15-LOX、p38MAPK、磷酸化p38MAPK( phosphorylated-p38MAPK, p-p38MAPK )、磷脂酶A2 ( cytosolic phospholipase A2,cPLA2)的动态表达,以及阿托伐他汀在脑缺血急性期的保护作用及其对12/15-LOX代谢通路的影响。方法:采用成年健康雄性Sprague-Dawley大鼠,应用改良Longa线栓法建立大鼠右侧MCAO模型。实验一:动态观察脑缺血后不同时间点12/15-LOX、p38MAPK、p-p38MAPK和cPLA2的表达;实验分为正常对照组、缺血后3 h、6 h、12 h、24 h、48 h、72 h六个时间点组。实验二:测定脑梗塞后阿托伐他汀的神经保护作用。实验动物随机分为假手术组(Sham)、MCAO组、阿托伐他汀小剂量组(MCAO + atorvastatin 5 mg/kg, Low dose)、阿托伐他汀大剂量组(MCAO + atorvastatin 20 mg/kg, High dose)。药物干预组动物于梗死后立即腹腔注射阿托伐他汀。MCAO组和Sham组给予等容量生理盐水。术后24 h对大鼠进行神经功能评分。评分完毕将动物断头处死,用干湿重法测定脑组织含水量,用2% 2,3,5-三苯基四唑氮红(triphenyltetrazolium chloride, TTC)染色法测定脑梗死体积,用免疫组化、Western blot和逆转录多聚酶链反应(Reverse Transcription– Polymerase Chain Reaction, RT-PCR)测定12/15-LOX、p38MAPK、p-p38MAPK和cPLA2的表达。实验三:观察脑缺血后阿托伐他汀对血脑屏障的影响。应用激光共聚焦技术观察干预前后脑血管外IgG含量变化,Western blot、RT-PCR检测干预前后血脑屏障紧密连接蛋白claudin-5的表达。结果:1脑缺血3 h后p38MAPK、p- p38MAPK及cPLA2表达开始升高,48 h达高峰,72 h逐渐下降。2脑缺血12 h后12/15-LOX表达开始升高,48 h达高峰,72 h逐渐下降。3 MCAO组、阿托伐他汀小剂量组和阿托伐他汀大剂量组大鼠均出现不同程度的左侧肢体偏瘫。阿托伐他汀大剂量组的神经功能评分低于MCAO组,但差异无统计学意义(High vs. MCAO: 1.50±1.22 vs. 2.20±0.33, P > 0.05)。阿托伐他汀小剂量组与MCAO组相比,神经功能评分无明显差异(Low vs. MCAO: 2.00±0.21 vs. 2.20±0.33, P > 0.05)。4阿托伐他汀小剂量组和阿托伐他汀大剂量组病变侧脑组织含水量均低于MCAO组,差异有统计学意义(High vs. MCAO: P < 0.01;Low vs. MCAO: P < 0.05)。阿托伐他汀大剂量组病变侧脑组织含水量明显低于阿托伐他汀小剂量组,差异有统计学意义(P < 0.05)。5 Sham组无梗死灶。与MCAO组相比,阿托伐他汀大剂量组梗塞体积明显减小,差异统计学意义(P < 0.05)。阿托伐他汀小剂量组与MCAO组相比,梗塞体积无明显减小。6阿托伐他汀大剂量组12/15-LOX、p38MAPK、p- p38MAPK及cPLA2表达降低,与MCAO组相比结果有统计学意义(P < 0.05)。阿托伐他汀小剂量组与MCAO组相比结果无统计学意义(P > 0.05)。7 Sham组脑组织无明显IgG外渗,MCAO组和阿托伐他汀小剂量组病变侧脑组织可见大量斑片状呈绿色荧光的IgG,阿托伐他汀大剂量组IgG含量减少。8与Sham组相比,MCAO组claudin-5表达明显下降。阿托伐他汀大剂量组claudin-5表达上调,与MCAO组相比结果有统计学意义(P < 0.05)。阿托伐他汀小剂量组与MCAO组相比结果无统计学意义(P > 0.05)。结论:脑缺血后脑组织中12/15-LOX、p38MAPK、p- p38MAPK及cPLA2的表达显著升高。大剂量阿托伐他汀可以减轻脑梗死体积,减轻脑水肿,其保护作用可能与下调12/15-LOX、p38MAPK、p- p38MAPK及cPLA2的表达,上调claudin-5的表达有关。