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肝癌恶性程度高,预后差。我国是肝癌的高发地,全球每年新发的肝癌病例中45%在我国大陆。其中一个重要原因是我国乙肝病毒携带者比例高,具有庞大的肝癌高危发病人群。目前的各种治疗手段仍无法从根本上改变肝癌的预后,亟待研究更为有效的方法用于肝癌的治疗。细胞因子诱导的杀伤细胞(Cytokine Induced Killer cells,CIK细胞)是自体外周血单核细胞在体外经多种细胞因子诱导培养产生的一类免疫杀伤细胞。CIK细胞在趋化因子的作用下到达肿瘤部位,可以直接杀伤或通过抗体依赖性细胞介导的细胞毒性效应(antibody dependent cell-mediated cytotoxicity,ADCC)来消灭自体或异体来源的敏感肿瘤细胞,但是单纯使用CIK细胞对肝癌患者进行治疗,临床疗效并不显著。干扰素是由病毒和其他种类的干扰素诱导剂,刺激网状内皮系统、巨噬细胞、淋巴细胞以及体细胞所产生的一种糖蛋白,主要通过抑制肿瘤病毒的增殖,阻遏癌基因的表达,阻断肿瘤细胞的分裂,调动机体免疫系统杀伤肿瘤细胞以及诱导肿瘤细胞的分化发挥抗肿瘤作用。但是干扰素的临床应用仍存在体内半衰期较短;需大剂量频繁给药;全身毒副作用强的问题,从而限制了通过提高剂量而提高疗效的方法,其临床应用具有很多局限性。本实验借助于嵌合型腺病毒Ad5F35作为载体将新型高活性干扰素基因TV1导入到CIK细胞内,然后将CIK细胞注射到裸鼠体内。CIK细胞可以靶向肿瘤部位,并在肿瘤部位高效、稳定表达干扰素,该方法克服了干扰素治疗中由于全身、大剂量和频繁给药所带来的副作用,也克服了单纯使用CIK细胞治疗效果不佳的缺陷,充分发挥了基因治疗和免疫细胞治疗两者的优势,起到了联合的抗肿瘤作用。本实验中所用到的治疗基因为新型高活性干扰素TV1(IFN-TV1)基因。IFN-TV1是采用基因穿梭法,由12种人干扰素α基因构建杂交文库,采用高通量筛选技术,筛选10万个克隆而得到的高活性新型干扰素,其抗肿瘤作用是目前已上市的国内外同类药物活性的200～400倍;其抗病毒活性是同类药物的10倍以上。因其具有广谱抗肿瘤、抗病毒的作用而成为治疗肝癌乃至推迟或防止肝硬化的极佳选择。同时基于治疗的安全性考虑,本实验还采用了单纯疱疹病毒胸苷激酶基因/丙氧鸟苷(HSV-TK/GCV)自杀基因系统,将HSV-TK基因插入到携带有IFN-TV1基因的腺病毒基因组中,当干扰素表达过量时,向裸鼠体内注射更昔洛韦(GCV)杀死表达干扰素的CIK细胞,从而降低干扰素表达,以防止干扰素表达过量所带来的副作用,增强治疗的安全性。本实验主要有以下三部分组成:一、携带IFN-TV1的腺病毒载体的构建和制备将IFN-TV1基因插入到含有CMV启动子的腺病毒载体pDC359中得到腺病毒穿梭载体pDC359-TV1,同时将TK基因插入到该载体中得到pDC459-TV1,pDC459-TV1与腺病毒骨架载体pAd5F35共转染293细胞,10天后出现病毒空斑,经过3次病毒空斑纯化,提取病毒基因组进行PCR鉴定,鉴定正确的腺病毒命名为Ad5F35-TV1-TK。经293细胞扩增、氯化铯密度梯度离心纯化、TCID50测得病毒Ad5F35-TV1-TK滴度为1.5×1010 pfu/ml。二、表达IFN-TV1的CIK细胞治疗肝癌的体外实验研究1、分别用Ad5-EGFP、Ad5F11-EGFP和Ad5F35-EGFP感染CIK细胞,比较其感染效率,结果表明与Ad5-EGFP、Ad5F11-EGFP相比,病毒Ad5F35-EGFP对CIK细胞感染效率明显升高,可以达到90%以上。2、ELISA方法定量检测腺病毒Ad5F35-TK-TV1感染CIK细胞后IFN-TV1的表达。根据检测数据可以看出当MOI=100时,2d、4d、6d和8d测得IFN-TV1的表达量均≥(17.16±4.70)ng达到并超过了IFN-TV1的有效剂量(IFN-TV1的治疗剂量为10pg级)。3、SRB法检测所表达IFN-TV1的生物活性。结果显示:当IFN-TV1浓度为1ng/ml时对肝癌细胞株7721和Huh7的抑制率分别为(61.01±12.84)%和(60.74±20.06)%,而对照IFNα-2b浓度为10ng/ml时,其对肿瘤细胞的抑制作用只有(35.70±11.26)%和(30.37±7.80)%,因此病毒Ad5F35-TV1-TK感染CIK细胞后所表达IFN-TV1对肝癌细胞株具有较强的抑制作用且明显强于对照IFNα-2b。4、LDH法检测不同效靶比的CIK细胞和CIK/Ad5F35-TV1-TK(Ad5F35-TV1-TK感染CIK细胞后24h)对肝癌细胞株7721和Huh7的杀伤作用。结果显示:腺病毒Ad5F35-TV1-TK感染CIK细胞后,CIK/Ad5F35-TV1-TK对肝癌细胞株的杀伤活性显著增强比单纯使用CIK细胞增强了20%以上,说明病毒感染CIK细胞后并未降低CIK细胞的抗肿瘤活性,反而发挥了联合的抗肿瘤效应。5、定量PCR检测TK基因表达。结果显示:Ad5F35-TV1-TK与Ad5F35-TV1和空白对照相比,TK基因能够有效表达。三、表达IFN-TV1的CIK细胞治疗肝癌的体内实验研究1、ELISA方法检测腺病毒Ad5F35-TV1-TK分别感染常氧和低氧条件下培养的CIK细胞经尾静脉注射到裸鼠体内后IFN-TV1的表达量。当MOI=100时,7d、10d、14d和21d检测常氧条件下培养的CIK细胞TV1的表达量普遍高于低氧条件下培养的CIK细胞,且其表达量高于治疗的有效剂量,达到(248.63±53.90)pg/ml。2、CIK细胞基因治疗系统对裸鼠移植瘤的抑制作用,CIK/Ad5F35-TV1-TK治疗组疗效明显优于PBS对照组,具有显著统计学差异(P=0.013)。3、CIK细胞基因治疗系统对荷瘤裸鼠生存期的影响。PBS对照组在治疗开始后第28天开始死亡,86天全部死亡。直至对照组小鼠全部死亡时,CIK/Ad5F35-TV1-TK系统治疗组裸鼠全部存活。结论:本课题成功构建了同时携带新型高活性IFN-TV1和HSV-TK基因的嵌合型腺病毒Ad5F35-TV1–TK,该病毒能高效感染CIK细胞,从而将治疗基因导入CIK细胞内,在体内高效、稳定表达IFN-TV1。CIK/Ad5F35-TV1 -TK治疗系统能显著抑制裸鼠移植瘤和延长荷瘤裸鼠生存期。该方案综合了肿瘤的基因治疗和细胞治疗的双重优势,弥补了单纯细胞治疗效果差的不足,也克服了传统基因治疗载体体内运输治疗基因效率低的缺陷,对肝癌具有显著的抑制作用,有望成为肝癌治疗新的突破。