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肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)(简称肝癌)是世界范围内最常见且恶性程度最高的恶性肿瘤之一。由于肝癌早期诊断率低,晚期失去手术机会,所以,尽管目前以手术为主的多学科的联合治疗使肝癌的5年生存率得到了较大提高,但肝癌的高发病率与致死率仍是目前亟待解决的难题。导致肝癌患者预后差的非常重要原因就是人们对肝癌病因及发生、发展的具体分子机制仍知之甚少。因此,研究探索与HCC发生发展密切相关的分子生物学机制对于提高诊断及治疗水平,改善预后具有十分重大的意义。AT富集区域4B(AT-rich interaction domain 4B,ARID4B)基因是ARID(AT-rich interaction domain)家族的一员。近年来,越来越多的研究表明,ARID4B基因在乳腺癌、肺癌、结肠癌、卵巢癌等多种组织中呈高表达,可能扮演癌基因的角色。已有研究发现ARID4B在肝癌组织中呈高表达,并发现其高表达与肿瘤数目、血管浸润、Edmondson-Steiner分级以及肿瘤淋巴结转移分期密切相关,但ARID4B在肝癌发生及发展过程中的作用尚不明了。本研究拟应用siRNA干扰技术在肝癌细胞中沉默ARID4B基因的表达,探讨其对肝癌细胞增殖及凋亡的影响及其可能的分子机制,以期为肝细胞癌的早期诊断、治疗提供新的潜在分子靶点。第一部分ARID4B基因在人肝癌细胞中的表达目的:从细胞水平检测ARID4B在不同肝癌细胞株中的表达情况。方法:利用RT-qPCR技术和Western blot分别检测ARID4B基因在人正常肝细胞株LO2、人肝癌细胞株HCCLM3、Hep3B、Hep G2、以及Huh-7中的mRNA和蛋白表达水平;结果:结果显示,与人正常肝细胞株LO2相比,人肝癌细胞株Hep3B、Huh-7中ARID4B基因mRNA和蛋白表达水平相对较低(P<0.01,P<0.001);人肝癌细胞株Hep G2中相对表达水平较高(P<0.001,P<0.01),而人肝癌细胞株HCCLM3中该基因mRNA和蛋白相对表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。结论:与人正常肝细胞株LO2相比,ARID4B基因在不同人肝癌细胞株中表达水平不同,其中在Hep G2中具有较高表达。第二部分特异性干扰序列siRNA对ARID4B干扰效果的鉴定及筛选目的:鉴定siRNA的干扰效果,筛选最佳干扰序列并确定其最佳作用时间与浓度。方法:将设计合成的两条针对ARID4B基因的靶向siRNA序列siRNA-1、siRNA-2以及二者等比例混合序列siRNA-1+2通过脂质体LipofectamineTM2000转染至Hep G2细胞后,用RT-qPCR技术及Western blot检测干扰效率,筛选出最佳干扰序列并确定其最佳作用时间与浓度用于下一步实验。结果:1.siRNA最佳干扰序列相比于空白对照组,人肝癌细胞株Hep G2转染阴性对照序列后,ARID4B的mRNA与蛋白表达量变化无明显差异(P>0.05);转染干扰序列siRNA-1、siRNA-2、siRNA-1+2后,均不同程度上抑制了人肝癌细胞株Hep G2中ARID4B mRNA与蛋白的表达(P<0.001),其中,序列siRNA-1+2的干扰效果最好。2.siRNA最佳作用时间人肝癌细胞Hep G2转染特异性干扰序列siRNA-1+2后,分别于24、48和72小时后采用RT-qPCR技术与Western blot法检测干扰效果,与阴性对照组相比,转染48小时后ARID4B mRNA与蛋白相对表达量最低(P<0.001,P<0.01)。3.siRNA最佳作用浓度将不同浓度的siRNA-1+2(0、15 nmol/L、30 nmol/L、60 nmol/L)转染至人肝癌细胞株Hep G2中,48小时后利用上述方法检测不同浓度的siRNA-1+2干扰效果。结果显示,与阴性对照组相比,siRNA-1+2(60nmol/L)能够明显的下调人肝癌细胞Hep G2中ARID4B基因的mRNA与蛋白表达(P<0.001)。其ARID4B mRNA的抑制率达到(70.54±0.53)%,蛋白抑制率为(60.00±9.17)%。结论:应用siRNA干扰技术,将ARID4B基因特异性靶向siRNA序列转染人肝癌细胞株Hep G2,能够成功介导ARID4B基因沉默,达到靶向下调ARID4B基因表达的目的。第三部分ARID4B基因沉默对人肝癌细胞Hep G2增殖与凋亡的影响目的:探讨ARID4B基因对人肝癌细胞株的增殖与凋亡的影响及其可能的分子机制。方法:1.转染siRNA靶向沉默ARID4B基因后,CCK-8法检测细胞的生长情况;2.采用流式细胞术检测沉默ARID4B后对肝癌细胞细胞周期及凋亡的影响;3.采用Western blot检测沉默ARID4B后与细胞增殖相关蛋白Cyclin D1、c-Myc、ERK1/2、P-ERK1/2及凋亡相关蛋白Cleaved Caspase-3、Bax、Bcl-2表达水平的变化。结果:1.CCK-8法检测转染后细胞生长情况与阴性对照组细胞相比,siRNA-1+2组在转染后24小时检测总的活细胞数无明显差异(P>0.05),而在转染后48小时、72小时两个时间点检测siRNA-1+2组中总的活细胞数明显下降(P<0.01,0.05)。2.流式细胞术检测转染后细胞周期分布及凋亡情况人肝癌细胞Hep G2在转染干扰序列siRNA-1+2 48小时后进行检测,与阴性对照组细胞相比,细胞G0/G1期,S期与G2/M期分布情况均无明显差异(P>0.05);与阴性对照组细胞((5.42±0.408)%)相比,转染siRNA-1+2组细胞((6.71±0.575)%)早期凋亡率相对较高(P<0.05)。3.Western blot法检测细胞增殖及凋亡相关蛋白的表达情况与阴性对照组相比,细胞增殖相关蛋白Cyclin D1、c-Myc、ERK1/2、P-ERK1/2蛋白的表达量在siRNA-1+2组细胞中无明显变化(P>0.05)。与阴性对照组相比,siRNA-1+2组细胞中凋亡相关蛋白Cleaved Caspase-3、Bax蛋白表达量明显升高(P<0.01,P<0.05),Bcl-2的蛋白表达量明显降低(P<0.01)。结论:1.沉默ARID4B基因后,对人肝癌细胞Hep G2增殖无明显影响。2.沉默ARID4B基因后,可导致人肝癌细胞Hep G2的凋亡率增加,其机制可能与上调Cleaved Caspase-3、Bax蛋白表达,下调Bcl-2蛋白表达有关,提示ARID4B可能成为肝癌治疗的一个新的靶点。