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木聚糖酶在造纸、饲料、食品以及能源等领域的应用价值已经得到了肯定,但由于纸浆处理通常是在高温条件下进行,在饲料制粒加工中也需要短暂的高温处理,很多天然的木聚糖酶热稳定性较差,成为它们在饲料、造纸行业中应用的瓶颈。因此,对木聚糖酶热稳定性的改良十分必要。
本实验室筛选的黑曲霉A-25是一株木聚糖酶高产菌株,由它分泌的β-1,4-内切木聚糖酶属于G/11家族,最适反应温度为48℃,不适于在高温的生物工程环境下使用。本研究将黑曲霉A-25所分泌的XynⅢ基因序列(登录号为EU375728)与另外两种已经引入二硫键的的木聚糖酶序列(登录号分别为P55329和P36217)进行序列比对,并设计7对突变引物,分别将原蛋白序列的第30位、47位、128位、130位、174位、177位、178位的氨基酸替换为半胱氨酸,即(G30C；D47C；V128C；S130C；N174C；N177C；F178C)。
通过组合,用重叠延伸PCR和常规PCR对野生酶基因进行定点双突变,获得四对突变基因即四对二硫键(G30C:D47C,S130C:N174C,S130C:N177C,V128C:F178C)。突变基因经过酶切、酶连、转化和电泳鉴定,突变基因确实克隆到表达载体pET20b上。将含有突变基因的重组质粒转化入大肠杆菌中诱导表达,获得具有木聚糖酶活性的蛋白。
通过对重组酶的酶学性质进行研究发现:野生酶在50℃保温30min后残余酶活为18％左右,突变体酶S130C/N174C和V128C/F178C分别为70％和80％,其热稳定性较野生酶的提高了四倍左右；而S130C/N177C和G30C/D47C的热稳定性与野生酶相比有所降低,48℃保温30min后G30C/D47C的残余酶活仅为20％,50℃保温30min后几乎为零；S130C/N177C在48℃保温30min后酶就完全失活；S130C/N174C和V128C/F178C在50℃条件下的半失活时间有原来的12min分别提高到31min和25min。总体说来本研究成功地对黑曲霉木聚糖酶进行了改造,热稳定性有了一定程度的提高,木聚糖酶的酶学性质得到了改良。