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胚胎早期发育的分子机理是发育生物学研究的核心问题,早期胚胎发育涉及的基因较多,分子间的相互作用网络错综复杂。斑马鱼胚胎体外发育,胚体透明,胚胎数量大且胚胎发育进程较为一致,历经20多年的研究发展斑马鱼已成为胚胎发育研究的理想模式动物。斑马鱼卵母细胞受精后启动胚胎的发育进程,卵质流向动物极形成了一个无卵黄颗粒的胚盘,依次经过卵裂期,囊胚期,外包期,器官形成期最后发育为幼体。受精后到MBT期之间合子基因组尚未启动,胚胎发育依赖卵中储存的母源因子引导胚胎早期发育,因而母源因子对斑马鱼乃至整个脊椎动物的早期胚胎发育都具有举足轻重的作用。
母源因子的定位决定了胚胎背腹轴,前后轴和生殖系的建立,三个主要的途径BMP;Wnt/β-catenin和Wnt/calcium影响了胚胎DV轴和AP轴的发生。母源因子定位与mRNA序列组成有关,一些母源mRNA均匀分布在卵细胞内,如β-catenin均匀分散在卵的胞质内,而另一些母源mRNA有特异的定位表达模式,包括动物极,植物极或者皮质三种定位方式。
目前已知的母源因子数目很少,寻找引导早期胚胎发育的母源因子是认识早期胚胎发育过程的关键。寻找新的母源因子,揭示胚胎发育的基因调控规律是本论文的原始出发点。本文利用同源克隆的方法从斑马鱼卵母细胞中克隆了一个含有F-box结构域的功能未知蛋白,生物信息学分析结果提示其N末端含有一个F-box区,C末端有一个WD-40区。因与鼠的FBXW14有98%的同源性,参考F-box蛋白的国际命名标准将该基因命名为FBXW14。此外FBXW14还包含6个GSK3磷酸化识别位点,8个PDZⅢ结合区,6个CK2磷酸化位点。PDZⅢ可以转运并定位合适的蛋白到细胞的信号传递位点,调节膜蛋白的活性和转运,PDZⅢ结合区是说明FBXW14基因功能的重要参考。
RT-PCR基因表达pattern分析表明,FBXW14mRNA信号在卵母细胞和卵裂期处于最高水平;随着胚胎发育进程的推进FBXW14表达量逐渐下降,卵母细胞至50%外包期时表达量无明显差异,在随后的发育中FBXW14基因表达量逐渐减弱。原位杂交的时空表达模式分析表明,FBXW14定位在卵母细胞的皮质区,卵母细胞受精激活后FBXW14沿胞质环流向胚盘汇集。FBXW14在30%外包期以后出现极性分布,自头部向尾部表达逐渐下降,在36小时胚中只能检测到微弱杂交信号。反义Oligo-FAM和反义RNA显微注射分析显示FBXW14的loss-of-function确实影响了斑马鱼的体轴发育和体节的发育和延伸,以及胚胎外包时胚体与卵黄的紧密联系,头部及心血管系统的形成。
根据反义Oligo注射后的变异表型观察发现:胚体沿卵黄的外包过程决定了胚胎的器官和体节发生,胚体脱离卵黄颗粒以后将失去发育的方向性,发育为无明显结构的组织。胚盘下的卵黄合胞体层是胚胎中胚层和内胚层发育的调控区,近轴下胚层发育为体节,下胚层包括中胚层和内胚层。FBXW14的活性抑制并没有影响前后轴的建立,但干扰了胚体沿卵黄的外包,进而严重影响了胚胎体轴的发育。
FBXW14反义Oligo的死亡率远大于对照组,且同一类型的突变表型重复出现,说明反义Oligo在基因功能抑制的研究中是有效的。较高剂量反义Oligo显微注射1细胞胚,胚胎死亡率急剧增大,并且大于对照Oligo显微注射的结果,说明FBXW14的完全缺失对胚胎是致死的。
本文首次在斑马鱼卵母细胞中克隆到的FBXW14蛋白与小鼠FBXW14有很高的同源性,说明FBXW14是高保守蛋白,且FBXW14的F-box区与SEL-10和β-Trcp等重要发育相关蛋白具有很高同源性。高保守性暗示了FBXW14生物学功能的重要性,因而找到FBXW14的识别底物将是一个值得期待的发现。