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背景与目的大肠癌是近二、三十年来发病率和死亡率在世界大多数国家和地区上升最快的肿瘤之一。流行病学资料显示大肠癌已上升为全球第3位最常见的癌症。大肠癌患者的生存期与疾病阶段密切相关,如果发现早,可以经手术治愈,若已发生转移,则预后差,死亡率极高,因而早期诊断、早期治疗是提高大肠癌疗效的关键。近年对胰岛素样生长因子系统(Insulin-like growth factor system,IGFs)在大肠癌发生、发展中作用及机制的研究成为一个热点。胰岛素样生长因子系统包括胰岛素样生长因子(IGF-I及IGF-Ⅱ)、胰岛素样生长因子受体(IGF-IR及IGF-ⅡR)以及胰岛素样生长因子结合蛋白IGFBPs,在上皮生长、抗凋亡及促有丝分裂中起重要作用,大量证据显示IGFs调控着各种癌的生长及增生。IGF-I、IGF-Ⅱ促进癌细胞生长的作用是通过IGF-IR介导的。其中IGF-Ⅱ是由67个氨基酸组成的弱酸,通过内分泌、旁分泌及自分泌方式作用于各种哺乳动物细胞,从而调节细胞的增生、凋亡、转化及分化,对人类正常生长及发育非常重要。近年国内外研究发现,IGF-Ⅱ在大多数结肠癌细胞株及结肠癌组织表达均增加。还有研究显示,IGF-Ⅱ基因印迹缺失(LOI)包括正常沉默的母性遗传等位基因异常活动与个体或家族大肠肿瘤形成有关。大肠肿瘤/癌患者IGF-Ⅱ的LOI较健康人高5.1倍,表明IGF-Ⅱ基因可作为预测大肠癌危险性的一个标记。血液循环中,成人IGF-Ⅱ浓度是IGF-I的3倍,浓度稳定,对生长激素的依赖性及年龄因素对其影响均较IGF-I小。故研究IGF-Ⅱ在大肠癌的意义有很高的临床价值。大部分IGFs在循环中与IGFBP结合,后者调控着IGFs的生物活性。所有IGFBPs都通过与IGF高度粘合而抑制IGF活性,同时其中一些结合蛋白也有活化IGFs效应。所以IGFBPs在癌的发生中起着重要作用。IGFBP-4是以糖基化及非糖基化两种形式存在的最小的IGFBP。几乎所有结肠癌细胞株都分泌IGFBP-4,其主要功能是通过与IGF-I、IGF-Ⅱ同等结合作为结肠癌细胞株的抑制蛋白,其被认为是唯一的抑癌蛋白。目前对IGFs与大肠癌关系的认识,尤其是IGFBP-4与大肠癌的认识多来源于体外实验,国内尚未见有关报道,需要通过大量体内及动物研究来证实,以便用于结肠癌的预防和早期诊治。本课题拟通过检测IGFs在人大肠癌组织、相应癌旁正常组织、癌前病变-腺瘤组织基因及其产物表达,分析其与大肠癌的发生、浸润、分化、转移及预后的相关性,探讨其在大肠癌诊断、病情及预后判定中的意义;再进一步检测上述组织来源患者血液循环中IGF-Ⅱ、IGFBP-4的水平,并与同步检测的CEA、CA19-9比较,探讨其血清诊断学价值。以期获得更多IGFs在大肠癌作用的体内研究资料,更好地为临床大肠癌的诊治提供参考。材料和方法组织标本选自2005年6月至2006年2月本院手术切除和内镜活检并经病理证实的肿瘤标本及远离肿瘤10cm以上区域的相应癌旁正常组织标本,大肠癌48例,男28例,女20例,年龄21～81岁,平均年龄61岁;胃癌21例:男14例,女7例,年龄40～80岁,平均年龄63岁;食管鳞癌23例,其中男17例,女6例,年龄42～81岁,平均年龄58岁;结直肠腺瘤患者内镜高频电切标本20例,其中男13例,女7例,年龄27～77岁,平均年龄57岁。血清标本源自上述大肠癌及大肠腺瘤患者及正常对照20例,男12例,女8例,年龄23～65岁,平均年龄41岁,为正常献血及体检正常的自愿者。应用RT-PCR、免疫组化技术,检测IGFs在癌组织、腺瘤组织、癌旁正常组织基因及其产物表达,采用ElISA、放免技术和电发光技术检测血清IGF-Ⅱ、IGFBP-4、CEA和CA19-9的水平。实验数据采用SPSS 10.0统计软件行统计学分析,计量资料采用x±s表示,两组表达率比较采用χ2检验,两组均数比较采用t检验,多组均数比较采用单因素方差分析。相关性分析采用Spearman相关检验。结果一.大肠癌组织IGF-Ⅱ、IGF-I及IGF-IR的表达1.大肠癌组织IGF-Ⅱ、IGF-IR mRNA表达水平为0.979±0.436和0.607±0.327,均高于癌旁正常组织(0.293±0.261和0.333±0.227 ,均为P﹤0.05),IGF-I mRNA表达水平为0.529±0.546,与癌旁正常组织(0.329±0.194)比较差异无统计学意义(P﹥0.05)。大肠癌组织IGF-I mRNA表达率为79.2%(26/48),低于IGF-Ⅱ、IGF-IR mRNA(均为100% (48/48),P﹤0.01)。腺瘤组织三者比较无统计学差异(P﹥0.05)。正常组织IGF-ⅡmRNA表达率较IGF-I及IGF-IR mRNA低(P﹤0.01)。2. IGF-Ⅱ蛋白的阳性表达主要位于细胞胞质内,大肠癌的阳性表达率为100%,腺瘤为65.0%,正常组织为22.9%;癌、腺瘤均高于正常组织,癌更显著(P﹤0.05)。3.在正常组织、腺瘤及大肠癌组织,IGF-ⅡmRNA表达水平为0.293±0.261、0.633±0.484和0.979±0.436,依次增高(P﹤0.01);并且在大肠癌,IGF-ⅡmRNA表达水平随Duke A、B、C、D期逐渐增高(P﹤0.01);低分化癌较高、中分化癌及肿块直径≥5cm癌较<5cm癌增高(P﹤0.01,P﹤0.05);但在肿瘤不同部位间IGF-ⅡmRNA表达差异无统计学意义(P﹥0.05)。二.大肠癌组织IGFBP-4和MMP-7的表达1. 89.6%大肠癌组织、80.0%腺瘤组织、68.8%正常组织检测到IGFBP-4 mRNA扩增产物;大肠癌、腺瘤组织IGFBP-4 mRNA表达水平为0.482±0.197和0.313±0.216,均高于正常组织(0.186±0.166,P﹤0.01),但随着Dukes A、B、C、D期进展,表达逐渐下降,以D期最为显著(P﹤0.01),且绒毛状/混合型腺瘤表达低于管状腺瘤,低分化癌低于高、中分化癌(均P﹤0.01),肿瘤不同部位及大小间表达无统计学差异(P﹥0.05)。2. IGFBP-4蛋白的阳性表达主要位于细胞胞质内,正常组织、大肠癌和腺瘤IGFBP-4蛋白免疫组化平均积分分别为0.896±0.881,2.250±0.910和3.500±1.011,癌、腺瘤均低于正常组织,癌降低尤为显著,39.6%大肠癌患者组织未见表达,三组间比较差异有统计学意义(F=91.775,P﹤0.01)。3. 48例大肠癌组织均检测到MMP-7 mRNA扩增产物,正常组织未检测到扩增产物(P﹤0.01),癌组织MMP-7 mRNA表达水平显著高于正常组织(P﹤0.01),肿瘤侵及外膜以上及有淋巴结转移组表达上调更明显(P﹤0.05)。IGFBP-4与MMP-7 mRNA表达呈负相关(r =0.579,P﹤0.01)。三.大肠癌患者血清IGF-Ⅱ、IGFBP-4变化1.大肠癌、腺瘤患者及正常人血清IGFBP-4含量分别为(3.040±1.458),(3.850±0.693)和(2.600±0.780)ng/ml,三组间比较差异无统计学意义(P﹥0.05)。2.大肠腺瘤、大肠癌患者血清IGF-Ⅱ水平为(0.79±0.24)ng/ml、(1.05±0.45)ng/ml,明显高于健康对照组(0.50±0.15)ng/ml (P﹤0. 01),癌较腺瘤增高更显著(P﹤0.05)。大肠癌患者中,Dukes A、B、C三期IGF-Ⅱ水平较健康对照组显著增高(P﹤0.01),D期增高不明显(P﹥0.05),并较前三期显著下降(P﹤0.01);癌不同肿块大小、解剖部位及分化程度间差异无统计学意义(P﹥0.05)。3.联合检测IGF-Ⅱ、CEA、CA19-9较单项检测阳性率显著提高(P﹤0.05)。四.不同消化道肿瘤胰岛素样生长因子结合蛋白-4的表达1. IGFBP-4 mRNA在大肠癌、胃癌及食管癌组织的表达率分别为89.6%(43/48)、85.7%(18/21)及86.9%(20/23),三组间比较差异无统计学意义(P﹥0.05)。癌组织IGFBP-4 mRNA表达水平胃癌组织高于大肠癌及食管癌(P﹤0.01),不同病理类型癌组织(腺癌、黏液腺癌、混合癌、鳞癌)间比较差异无统计学意义(P﹥0.05)。2.大肠癌的IGFBP-4蛋白阳性表达率为60.4%;胃癌为71.4%;食管癌为60.9%;癌组织阳性表达率均低于相应的癌旁正常组织(均P﹤0.05),但三种癌组织之间比较差异无统计学意义。(均P﹥0.05)3.食管鳞癌IGFBP-4 mRNA表达水平为0.503±0.245,高于正常组织(0.291±0.240, P﹤0.01),但在肿瘤侵及外膜以上及有淋巴结转移者表达降低(P﹤0.01),在不同年龄、性别及肿瘤大小间表达差异无统计学意义(P﹥0.05)。结论一.IGF-Ⅱ、IGF-IR、IGFBP-4与大肠癌的发生、发展中有关,IGF-I与大肠癌无明确相关性。二. IGF-Ⅱ促进了大肠癌的发生与发展;在正常组织、腺瘤、大肠癌组织其表达逐渐增高,IGF-ⅡmRNA过表达与大肠癌的浸润深度、分化程度及肿瘤大小有关,检测IGF-ⅡmRNA表达对大肠癌的早期诊断及预后判断有重要意义。三.IGFBP-4作为肿瘤抑制因子参与大肠癌的发生、发展,与大肠癌的Duke分期、分化程度及大肠腺瘤的病理分型有关,大肠癌早期IGFBP-4mRNA表达上调,晚期表达下调,其对预测大肠肿瘤的病情及预后有重要参考价值。四.IGFBP-4主要在大肠癌组织局部发挥作用,血清学价值有限。大肠癌组织IGFBP-4基因及蛋白表达存在差异,可能与转录后翻译及MMP-7调节有关。五.血清IGF-Ⅱ变化与大肠肿瘤的发生、发展有密切关系,与CEA、CA19-9联合检测,可显著提高大肠癌的诊断阳性率。有望成为大肠腺瘤、大肠癌的一种很有前途的肿瘤标记物。六.消化道不同部位、不同病理类型肿瘤间IGFBP-4表达无差异,作用亦相似,主要影响晚期癌的进展。