芒果胶孢炭疽病菌遗传转化体系的建立

• 作 者: 李伟
• 机 构: 海南大学
• 出 处: 华南热带农业大学 海南大学
• 发表日期: 2004年期
• 关键词: 胶抱炭疽菌 遗传转化 农杆菌介导法 潮霉素磷酸转移酶

本研究基于农杆菌介导的插入方法，建立了芒果胶孢炭疽菌（collecotrichum gloeosporioides，以下简称CG）高效的CG遗传转化体系，并获得一批CG的T-DNA插入突变体，其目的是为CG的功能基因组学研究和致病相关基因的克隆奠定基础。主要研究内容如下： 1．分别从海口、湛江、两院三地采集到CG菌株进行纯化培养，通过芒果接种实验，对发病率、发病指数及菌株的产孢能力三项测试，最终确定选用接种发病率为100％，病情指数为71.1，菌株产孢能力达1.2×10⁶个／ml的两院第5号菌株（缩写为LCG5），其致病力比较强，产孢能力可以保证了转化体系的成功建立，方便对突变体库的致病和产孢相关突变体的筛选。 2．在农杆菌与LCG5共培养的过程中，对以下几项内容进行条件摸索： 农杆菌的最佳转化菌液浓度测定：实验结果显示，农杆菌的茵液的最适合的浓度为OD₆₆₀=0.15。 共培养基pH值的筛选：在微酸性条件下，设定三个pH梯度分别进行转化，结果表明转化效率最高的共培养用的培养的pH值为5.5。 选择转化效率最高的菌株：在潮霉素筛选浓度为200PPM，菌液浓度为OD₆₆₀=0.15条件下，选择pH5.5的IM共培养基，三种农杆菌进行转化的实验结果显示，农杆菌AGL-1转化效率最高。 探索AS对LCG5转化效率的影响：对比200umol／L的AS与不加AS的共培养条件的LCG5转化效率，结果表明，AS可以大大提高农杆菌LCG5的效率。 3．将各种参数优化后建立LCG5遗传转化体系，并利用该体系对LCG5进行遗传转化实践和转化质量检验。结果表明：平均每1×10⁵个LCG5孢子可得到30多个抗潮霉素的抗性克隆；继代稳定性测定结果，所有抗性克隆都表现出极好的抗潮霉素稳定性；用转化LCG5的质粒中的抗潮霉素基因序列设计华南热带农业大学2004级李伟引物，从抗性克隆中随机抽样进行PCR检测，结果全部参试克隆均扩增到与潮霉素基因同源的目的片段，证明LCGS基因组己经插入了潮霉素磷酸转移酶基因，也表明用己经组建的遗传转化体系进行LCGS遗传转化结果的假阳性率低。 4.对获得的LCGS突变体，在菌落形态和产抱量上与野生型进行培养性状比较，结果得到3个菌落形态异常突变体，6个产抱能力下降突变体。