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背景:
乳腺癌是影响女性健康的最常见的恶性肿瘤。尽管乳腺癌辅助治疗近年来取得一定进展，但面对无法切除复发转移的、三阴性乳腺癌治疗手段仍然有很大局限，并且2010年美国有39，840人死于乳腺癌，侵袭与转移是导致其复发和治疗失败的主要原因。更好的阐明乳腺癌的侵袭转移的机制将有助于寻找新的治疗靶点并确定更准确的临床病理预后因素。
HH信号传导通路在胚胎发育、器官形成、干细胞维持和肿瘤发生过程中都有重要生理和病理意义。它不仅参与发育和再生，当该信号持续激活还会导致祖细胞的转化及癌症发生，如小细胞肺癌、前列腺癌和消化道肿瘤等。已经有报道发现在乳腺癌中存在HH信号传导通路异常的再激活。Gli蛋白位于HH信号传导通路的末端，在信号传导通路激活时执行着调控转录程序的功能。Gli1 mRNA被认为是HH信号传导通路激活的一个可靠的指标。该信号通路对控制多种类型细胞转移与迁移及血管形成发挥重要作用，已经证实该信号通路参与了神经胶质瘤、卵巢癌、胃癌、食管癌、胰腺癌、前列腺癌等肿瘤的再生、侵袭与转移。但该信号通路参与乳腺癌的侵袭与转移的作用及机制研究较少。
天然药物在肿瘤的治疗中发挥着十分重要的作用。表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechin-3-gallate，EGCG)是绿茶中具有抗肿瘤作用的一种生物活性酚，其具体抗肿瘤机制尚未明了，众多研究提示EGCG可能通过抗氧化、诱导肿瘤细胞凋亡、诱导肿瘤细胞周期阻滞、抑制肿瘤细胞侵袭转移和血管生成、降低肿瘤细胞对化疗药物的耐药性、抑制核转录因子NF-κB的活化等方面来发挥抗肿瘤作用。但EGCG对乳腺癌侵袭转移的影响研究较少，与Hedgehog/Gli1通路的相关性更是鲜见报道。
基于以上的认识，本研究拟探讨Hedgehog/Gli1通路介导乳腺癌细胞的侵袭转移作用及其可能的机制;同时探讨EGCG对Hedgehog/Gli1通路介导乳腺癌细胞侵袭转移影响的可能机制。以探索乳腺癌侵袭转移新机制，寻求乳腺癌治疗新靶点，并针对该靶点寻找有效抑制乳腺癌侵袭转移的抑制剂。
目的:
1.研究Hedgehog/Gli1通路对乳腺癌细胞侵袭转移的影响;
2.探讨Hedgehog/Gli1通路影响乳腺癌细胞侵袭转移的可能机制;
3.研究EGCG对Hedgehog/Gli1通路介导乳腺癌细胞侵袭转移的影响;
4.探讨EGCG对Hedgehog/Gli1通路介导乳腺癌细胞侵袭转移影响的可能机制。
方法:
1.免疫化学法检测乳腺癌、癌旁组织，转移淋巴结组织中Gli1的蛋白表达;
2.Wound-healing划痕实验检测通路配体Shh，通路抑制剂KAAD-cyc，NF-κB通路的抑制剂PDTC和EGCG对人乳腺癌MCF-7，MDA-MB-231细胞转移运动能力的影响;
3.Transwell侵袭实验检测Shh，KAAD-cyc，PDTC及EGCG对人乳腺癌MCF-7，MDA-MB-231细胞侵袭能力的影响;
4.细胞粘附实验检测Shh，KAAD-cyc，PDTC及EGCG对人乳腺癌MCF-7，MDA-MB-231细胞粘附能力的影响;
5.MTT法检测EGCG对人乳腺癌MCF-7，MDA-MB-231细胞增殖能力的影响;
6.RT-PCR检测Shh，KAAD-cyc，PDTC及EGCG对人乳腺癌MCF-7，MDA-MB-231细胞NF-κB，Gli1，MMP-9及CyclinD2 mRNA表达的影响;
7.Western blot检测Shh，KAAD-cyc，PDTC及EGCG对人乳腺癌MCF-7，MDA-MB-231细胞NF-κB，Gli1，MMP-9及CyclinD2蛋白表达的影响;
8.TUNEL法检测Shh，KAAD-cyc，PDTC及EGCG对人乳腺癌MCF-7，MDA-MB-231细胞凋亡的影响。
结果:
1.Gli1蛋白在复发转移性乳腺癌组织表达显著增加，在发生复发转移的患者乳腺癌组织中，93.3％为Gli1高表达，没有发生转移的癌组织标本中81.2％高表达;同时我们进行了癌间质中Gli1表达分析，发现复发转移组原发癌间质Gli1过表达率为89.3％，而非复发转移组间质Gli1过表达率仅为13.4％;差异有统计学意义(P＜0.001)。
2.乳腺癌组织Gli1蛋白的表达与乳腺癌的早期复发转移密切相关，Gli1核过表达与RFS(无复发生存)呈明显相关(p=0.046)。在癌组织Gli1核高表达组乳癌复发率为17.8％，而Gli1低表达组乳癌复发率仅为6.2％(p=0.046)。癌间质Gli1高表达组乳癌复发率为31.2％，而Gli1低表达组乳腺癌复发率为11.1％(p＜0.001);
3.Shh（0.13μg/mL,0.5μg/mL）能明显增加人乳腺癌MCF-7，MDA-MB-231细胞的侵袭、转移及粘附;
4.KAAD-cyc(1μmol/L，4μmol/L)显著降低人乳腺癌MCF-7，MDA-MB-231细胞的侵袭、转移及粘附;
5.PDTC(20μmol/L，50μmol/L)明显抑制人乳腺癌MCF-7，MDA-MB-231细胞的侵袭、转移及粘附;
6.Shh(0.13μg/mL，0.5μg/mL)显著增加人乳腺癌MCF-7，MDA-MB-231细胞的Gli1，MMP-9的mRNA和蛋白表达，NF-κBp65 mRNA水平没有明显变化，降低CyclinD2的mRNA和蛋白表达，抑制凋亡;
7.KAAD-cyc(1μmol/L，4μmol/L)明显减少了人乳腺癌MCF-7，MDA-MB-231细胞中Gli-1，MMP-9的mRNA和蛋白表达，NF-κBp65 mRNA水平没有明显变化，促进CyclinD2的mRNA和蛋白表达，促进凋亡;
8.PDTC（20μmol/L，50μmol/L）明显抑制了人乳腺癌MCF-7，MDA-MB-231中NF-κB，Gli1及MMP-9的mRNA和蛋白表达，促进CyclinD2的mRNA和蛋白表达，促进凋亡;
9.EGCG(10μmol/L，20μmol/L)明显减少了人乳腺癌MCF-7，MDA-MB-231的侵袭、转移及粘附，同时显著减少人乳腺癌MCF-7，MDA-MB-231中NF-κB，Gli1及MMP-9的mRNA和蛋白表达，促进CyclinD2的mRNA和蛋白表达，促进凋亡。
结论:
1.Hedgehog/Gli1信号通路参与乳腺癌的侵袭转移，Gli1高表达可能在乳腺癌的浸润和转移过程中起重要作用，癌症发生复发转移前已经存在间质分子改变，Gli1可以用于预测乳腺癌的复发转移。
2.Hedgehog/Gli1信号通路参与乳腺癌侵袭转移的机制包括上调NF-κB信号通路活性，Hedgehog/Gli1和NF-κB信号通路交互活化，增加MMP-9的表达;
3.EGCG能显著抑制乳腺癌细胞的侵袭转移;
4.EGCG抑制乳腺癌细胞侵袭转移的机制与抑制Hedgehog/Gli1信号通路的激活、抑制NF-κB通路的活性和抑制MMP-9表达有关;提示Hedgehog/Gli1信号通路可能成为治疗乳腺癌的新靶点，并将为揭示乳腺癌侵袭转移的新机制及发现新的抑制药提供重要理论依据。