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本研究以云芝菌种为原材料，通过液体深层发酵技术获得发酵液以及菌丝体，从发酵液中获得胞外多糖提取物(EPCV)，菌丝体中获得胞内多糖提取物(IPCV)。利用DEAE-纤维素以及交联葡聚糖G-100柱层析纯化这两种多糖提取物，并将纯多糖作用于巨噬细胞RAW264.7，研究云芝多糖对巨噬细胞分泌一氧化氮影响，探讨其作用机制。具体研究方法和结果如下:
1.通过浓缩、脱蛋白、醇沉、透析等一系列分离纯化技术，从发酵液中获得EPCV，菌丝体中获得IPCV。经检测，EPCV中多糖含量为59.81％，其中总糖、还原糖、蛋白质的含量分别为63.91％、4.10％、0.96％;IPCV中多糖含量为63.44％，其中总糖、还原糖、蛋白质的含量分别为66.58％、3.14％、0.36％;
2.通过单因素试验，确定多糖提取物与DEAE纤维素树脂的最佳作用条件。其中，IPCV与DEAE纤维素树脂的最佳吸附pH值、解吸附氯化钠浓度、解吸附pH值分别为7.8，0.2 M，7.2;EPCV的则分别为8.0，0.4 M，7.4。
3.使用DEAE-纤维素柱层析纯化云芝多糖提取物。纯化后，胞外多糖的得率为26.78％，多糖含量为95.26％;胞内多糖的得率为56.28％，多糖含量为84.04％。胞外、胞内的多糖含量分别提高了35.45％、20.6％。这表明DEAE-纤维素对云芝多糖具有良好的纯化作用。
4.使用交联葡聚糖G-100柱层析进一步纯化云芝多糖。纯化后，胞外多糖的得率分别为47.73％，多糖含量达到了96.84％;胞内多糖得率为52.49％，多糖含量达到了93.79％;两种多糖均不再含有还原糖和蛋白质。这表明交联葡聚糖G-100对两种云芝多糖均具有良好的纯化效果。
5.使用MTT法确定云芝多糖对小鼠巨噬细胞RAW264.7的安全浓度范围。结果显示，与空白组相比，EPCV或IPCV在浓度为25-400μg/mL的范围内均不会对巨噬细胞RAW264.7的生长产生抑制作用(P＞0.05)，但当多糖浓度升高至1600μg/mL时，EPCV或IPCV均会极显著抑制巨噬细胞RAW264.7的生长(P＜0.01)。因此，两种多糖的安全浓度范围宜确定在0-400μg/mL之间。
6.使用ELISA法检测两种多糖对巨噬细胞分泌NO的影响。结果显示:EPCV或IPCV在浓度为25-200μg/mL的范围内，均能极显著抑制脂多糖(LPS)对巨噬细胞RAW264.7分泌NO的诱导作用(P＜0.01)，EPCV和IPCV的最佳浓度分别为50μg/mL、100μg/mL，最适作用时间均为6h。
7.使用ELISA法检测两种多糖对巨噬细胞内iNOS和NF-κB p65表达量的影响，探讨云芝多糖的作用机理。结果显示:EPCV或IPCV对LPS诱导巨噬细胞内iNOS以及NF-κB p65的表达均起到显著的抑制作用(P＜0.05)。这提示我们，云芝多糖可能是通过下调LPS对巨噬细胞内iNOS以及NF-κB p65表达的诱导作用，从而降低细胞内NO的分泌。