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世界卫生组织统计显示，肿瘤发病率和死亡率在全球迅速增长，严重威胁人们生命健康。在中国，肺癌发病率和死亡率均位于首位，已成为重大公共卫生问题之一。肿瘤发病是环境和遗传因素共同作用的结果，肺癌的环境病因学已较为明确，但遗传改变是一个多阶段的复杂生物学过程，明确该过程的早期生物效应，是早期发现并且干预肺癌进展的有效分子工具，也是降低死亡率的关键。表观遗传机制研究使得该目标的实现成为可能。表观遗传分子在对外界环境的应答上，比编码蛋白质的 mRNA 要迅速的多，对其进行干扰调控更及时，更容易逆转下游的生物学效应。因此表观遗传分子改变属于早期分子生物标记，对其研究可为肺癌早期诊断和早期预防带来希望。长链非编码 RNA(long non-coding RNA, lncRNA) 是目前表观遗传的关键研究领域之一，且lncRNA具有组织特异性和疾病特征性，基于基因组学和生物信息学技术的快速发展，探讨肺癌发生发展过程中lncRNA特异性改变及其调控机制，不仅可深入了解肺癌的发病机理，更重要的是为肺癌早期诊断和早期干预提供可能生物标志。因此，本研究首先选择TCGA（The Cancer Genome Atlas）数据库筛选肺癌相关lncRNA，并结合GEO （Gene Expression Omnibus）数据库对肺癌关键候选lncRNA进行分析。其次通过对中国汉族肺癌人群病例对照研究进一步探讨肺癌相关 lncRNA 在肺癌人群组织和血清中的表达情况，分析其表达水平与肺癌诊断价值、肺癌发病风险以及与肺癌病人临床特征之间的关系，最终筛选出与肺癌诊断密切相关的lncRNA潜在生物标志物。在此基础上，以筛选出的关键分子 LINC00961 为研究对象，检测其对肺癌A549细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响，并深入研究LINC00961的调控通路。最后，结合最新的m6A RNA甲基化表观遗传调控理论，应用MeRIP-seq 技术对受 m6A RNA 甲基化调控的 lncRNA 进行了进一步探索，并检测了lncRNA在m6A RNA甲基化关键蛋白调控肺癌发生发展过程中的变化趋势，为进一步了解肺癌发生发展机制和肺癌潜在生物标志物筛选提供理论依据。
研究方法
1. 本研究首先将纳入了TCGA数据库中肺腺癌和肺鳞癌人群，按照肺癌分期和淋巴转移进行分组，并对RNA 测序数据进行表达差异倍数计算。选取交集差异化表达基因，作为与肺癌分期和淋巴转移相关的关键差异化表达基因，并通过GEO数据库对关键基因进行验证。随后应用Cox比例风险回归模型对肺癌预后相关lncRNA进行筛选，构建肺癌风险评分。综合分析了肺癌中lncRNA的潜在生物标志物作用。
2. 为研究与肺癌病人分期、转移等临床特征密切相关，并参与肺癌相关通路的关键lncRNA（AFAP1-AS1、CHIAP2、DGCR5、FER1L4、LINC00472、LINC00961和MGC27382），本研究应用qRT-PCR技术在100对中国汉族人群肺癌组织及癌旁组织和 148 例中国汉族肺癌病人血清及 165 例健康对照人群血清中对其表达水平进行研究，运用logistic回归方法分析lncRNA与肺癌发病风险的相关性，应用 ROC 曲线分析 lncRNA 表达水平与肺癌诊断价值之间的关系，最后分析lncRNA表达水平与肺癌病人临床特征之间的关系。
3. 针对筛选出的关键分子 LINC00961 ，构建过表达慢病毒载体，培养LINC00961稳定转染A549细胞株，应用qRT-PCR检测其转染效率，通过CCK-8实验、流式细胞术、划痕实验和Transwell细胞侵袭实验分别检测LINC00961过表达对肺癌细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响。在对 LINC00961 调控机制研究时，首先应用双荧光素酶报告基因和qRT-PCR筛选LINC00961靶向调控的miRNA，应用Western Blot技术检测LINC00961过表达对PI3K-AKT、MAPK和mTOR信号通路关键蛋白的影响，最后在裸鼠荷瘤实验探索LINC00961对肿瘤生长及 PI3K-AKT、MAPK 和 mTOR 信号通路的影响，结合体内体外实验来探讨LINC00961对肺癌可能的调控机制。
4. 为了探讨最新的m6A RNA甲基化及其对lncRNA的表观遗传调控机制在肺癌发生发展过程中的作用，首先检测了肺癌细胞 A549 和 B(a)P 16HBE 中的m6A RNA甲基化水平及关键甲基化转移酶METTL3的表达水平。应用MeRIP-seq检测技术对sh-METTL3稳定转染A549细胞中的lncRNA和mRNA进行m6A RNA甲基化水平和表达量检测；根据生物信息学分析结果检测METTL3对肺癌细胞生物学功能的影响；最后，结合sh-METTL3稳转A549细胞和B(a)P 16HBE的 m6A 测序结果，对差异化表达和 m6A 水平改变的 lncRNA 进行筛选，应用qRT-PCR技术进一步验证测序结果的准确性。
研究结果
1. TCGA肺癌相关lncRNA筛选
通过对TCGA中肺癌患者的数据分析，分别绘制出肺腺癌和肺鳞癌ceRNA调控网络。其中肺腺癌中共有21种关键lncRNA与临床特征之间存在相关性，肺鳞癌中共有25种关键lncRNA与临床特征之间存在相关性。进一步结合临床特征分析和可能参与的肺癌相关通路对肺腺癌和肺鳞癌中表达趋势一致的17种lncRNA进行分析，结果发现：7种lncRNA (AFAP1-AS1、CHIAP2、DGCR5、FER1L4、LINC00472、LINC00961和MGC27382)与肺癌的分期、转移等重要临床特征相关，并参与肺癌相关的GO功能和KEGG信号通路。GEO数据库的肺癌人群中测序结果分析显示，这7种关键候选lncRNA表达与TCGA数据分析结果相一致。经单变量和多变量Cox比例风险回归分析结果显示：肺腺癌和肺鳞癌中分别有4种和2种lncRNA与总体预后相关。随后通过上述lncRNA分别构建肺腺癌和肺鳞癌的预后风险模型，综合分析提示，风险评分可作为肺腺癌和肺鳞癌的单独预后指标，并具有较高的预后诊断价值。
2. 中国汉族肺癌人群关键lncRNA生物标志筛选
100对肺癌患者组织qRT-PCR结果显示，CHIAP2、LINC00472、LINC00961和 MGC27382 在肺癌组织中显著下调（P<0.05），而 AFAP1-AS1、DGCR5 和FER1L4在肺癌组织中显著上调（P<0.05）。AFAP1-AS1和LINC00472与病理类型显著相关。7 种 lncRNA 均与肺癌发病风险之间存在相关性（P<0.05），其中AFAP1-AS1、DGCR5 和 FER1L4 表达水平与肺癌发病风险呈正相关关系；CHIAP2、LINC00472、LINC00961和MGC27382表达水平与肺癌发病风险呈负相关。肺癌组织结果提示，7种lncRNA与肺癌的发生发展之间存在密切相关性，具有更高的机制研究价值。148例肺癌病人血清及165例健康对照人群血清qRT-PCR 结果显示，肺癌人群中的 CHIAP2、LINC00961、FER1L4、SFTA1P 和LINC00312 均显著性下调（P<0.05），其中 CHIAP2、LINC00961、SFTA1P 和LINC00312的表达水平与肺癌组织表达水平相符。lncRNA表达水平均与肺癌的发病风险之间存在显著相关性（P<0.05），且与肺癌发病风险呈负相关。联合ROC曲线分析结果发现，CHIAP2、LINC00961、SFTA1P和LINC00312具有较高的单独诊断价值和联合诊断价值（AUC=0.81），可能成为肺癌潜在的诊断潜在生物标志物。
3. LINC00961对肺癌生物学功能影响及机制研究
通过数据库分析和人群病例对照研究发现，LINC00961在肺癌组织和血清中都具有重要的诊断价值。生物信息学分析提示，LINC00961参与了多种肺癌相关调控通路，因此对其进一步开展功能和机制探讨。qRT-PCR结果显示：LINC00961在 A549 细胞和 B(a)P 16HBE 细胞中表达水平均下调。CCK-8 增殖实验显示， LINC00961可明显抑制A549细胞的增殖作用（P<0.05）。流式细胞术实验结果显示，LINC00961过表达可显著增加凋亡率（P<0.05）。划痕实验和Transwell实验结果显示， LINC00961 过表达的 A549 细胞的迁移和侵袭能力显著降低（P<0.05）。LINC00961 双荧光素酶报告基因检测提示，5 种 miRNA 可能与LINC00961 直接结合。qRT-PCR 和细胞回复实验结果显示：LINC00961 可能通过靶向调控miR-19a-3p、miR-19b-3p和miR-125b-5p影响肺癌的发生发展过程。经Western Blot技术检测后，蛋白表达结果显示，LINC00961稳定转染组中PI3K-AKT、MAPK和mTOR信号通路中的多种关键蛋白表达量明显降低（P<0.05）。裸鼠荷瘤实验结果显示：LINC00961 稳定转染组 A549 细胞成瘤体积显著减小（P<0.05）。Western Blot结果显示：LINC00961通过调控PI3K-AKT、MAPK和mTOR信号通路影响肿瘤生长。
4. m6A RNA甲基化调控lncRNA对肺癌生物学功能影响
m6A水平检测结果显示，A549细胞和B(a)P 16HBE细胞的m6A水平均显著升高，说明m6A RNA甲基化参与了肺癌的发生发展并起关键作用。qRT-PCR结果显示：A549细胞中METTL3的表达水平上调3.74倍，B(a)P 16HBE细胞中METTL3 的表达水平上调 2.81 倍。sh-METTL3 稳定转染 A549 细胞的 MeRIP-seq测序结果显示，共有29,840种基因表达水平发生改变，其中共有5,866种基因的表达水平具有显著性差异（P<0.05）；7,974种基因的m6A水平改变。联合分析结果显示，共有569种lncRNA的表达水平和m6A水平发生改变。细胞功能学实验结果显示：METTL3下调可显著增加细胞凋亡，降低细胞增殖、侵袭和迁移能力。经qRT-PCR检测结果显示，sh-METTL3稳转A549细胞中7种lncRNA （GABPB1-AS1、LINC00662、LINC01184、SNHG15、ZFAS1、MIR4435-2HG和PVT1）表达均下调，与MeRIP-seq测序结果相符。
研究结论
1. 通过对TCGA中肺癌患者的数据分析并构建ceRNA网络发现，共有29种和83种关键lncRNA参与肺腺癌和肺鳞癌ceRNA网络调控。其中共有17种关键 lncRNA 在肺腺癌和肺鳞癌中表达一致。进一步分析发现，AFAP1-AS1、CHIAP2、DGCR5、FER1L4、LINC00472、LINC00961和MGC27382与肺癌临床特征密切相关，并参与肺癌相关的通路。风险评分可作为肺腺癌和肺鳞癌的单独预后指标，并具有较高的预后诊断价值。
2. 通过对关键候选 lncRNA 在肺癌人群中的病例对照研究结合数据库分析结果发现，AFAP1-AS1、CHIAP2、DGCR5、FER1L4、LINC00472、LINC00961和 MGC27382 与肺癌的发病风险有密切相关性。结合肺癌血清和肺癌组织的表达结果分析发现，CHIAP2、LINC00961、SFTA1P和LINC00312具有较高的单独诊断价值和联合诊断价值，可成为肺癌潜在的诊断生物标志物。
3. LINC00961在肺癌A549细胞和B(a)P 16HBE细胞中表达均显著降低。过表达LINC00961可显著抑制A549细胞的增殖、促进凋亡、降低迁移、侵袭和抑制肿瘤形成。双荧光素酶报告基因检测、qRT-PCR、细胞回复实验和Western blot实验结果显示，LINC00961可能通过靶向调控miR-19a-3p、miR-19b-3p和miR-125b-5p调控PI3K-AKT、MAPK和mTOR信号通路进而影响肺癌的发生发展。
4. MeRIP-seq测序结果显示，METTL3下调m6A水平改变过程中，共有569种 lncRNA 表达水平发生改变。结合生物信息分析、生物学功能研究和关键lncRNA表达水平分析结果，提示m6A RNA甲基化可调控lncRNA影响肺癌细胞的生物学功能，在肺癌发生发展过程中起到重要作用。MeRIP-seq测序结果为肺癌发生发展过程中更深入的机制学探讨和生物标志物的发现提供了更有效的线索。
综上，本论文研究通过大数据分析筛选从而缩小研究范围，为后续的实验研究提供基础和参考，增加后续研究可靠性、准确性以及更高的针对性。最终为探索肺癌中发挥关键生物学作用的lncRNA分子提供线索，从而为肺癌的三级预防以及环境暴露健康评估提供可靠地理论依据。
研究方法
1. 本研究首先将纳入了TCGA数据库中肺腺癌和肺鳞癌人群，按照肺癌分期和淋巴转移进行分组，并对RNA 测序数据进行表达差异倍数计算。选取交集差异化表达基因，作为与肺癌分期和淋巴转移相关的关键差异化表达基因，并通过GEO数据库对关键基因进行验证。随后应用Cox比例风险回归模型对肺癌预后相关lncRNA进行筛选，构建肺癌风险评分。综合分析了肺癌中lncRNA的潜在生物标志物作用。
2. 为研究与肺癌病人分期、转移等临床特征密切相关，并参与肺癌相关通路的关键lncRNA（AFAP1-AS1、CHIAP2、DGCR5、FER1L4、LINC00472、LINC00961和MGC27382），本研究应用qRT-PCR技术在100对中国汉族人群肺癌组织及癌旁组织和 148 例中国汉族肺癌病人血清及 165 例健康对照人群血清中对其表达水平进行研究，运用logistic回归方法分析lncRNA与肺癌发病风险的相关性，应用 ROC 曲线分析 lncRNA 表达水平与肺癌诊断价值之间的关系，最后分析lncRNA表达水平与肺癌病人临床特征之间的关系。
3. 针对筛选出的关键分子 LINC00961 ，构建过表达慢病毒载体，培养LINC00961稳定转染A549细胞株，应用qRT-PCR检测其转染效率，通过CCK-8实验、流式细胞术、划痕实验和Transwell细胞侵袭实验分别检测LINC00961过表达对肺癌细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响。在对 LINC00961 调控机制研究时，首先应用双荧光素酶报告基因和qRT-PCR筛选LINC00961靶向调控的miRNA，应用Western Blot技术检测LINC00961过表达对PI3K-AKT、MAPK和mTOR信号通路关键蛋白的影响，最后在裸鼠荷瘤实验探索LINC00961对肿瘤生长及 PI3K-AKT、MAPK 和 mTOR 信号通路的影响，结合体内体外实验来探讨LINC00961对肺癌可能的调控机制。
4. 为了探讨最新的m6A RNA甲基化及其对lncRNA的表观遗传调控机制在肺癌发生发展过程中的作用，首先检测了肺癌细胞 A549 和 B(a)P 16HBE 中的m6A RNA甲基化水平及关键甲基化转移酶METTL3的表达水平。应用MeRIP-seq检测技术对sh-METTL3稳定转染A549细胞中的lncRNA和mRNA进行m6A RNA甲基化水平和表达量检测；根据生物信息学分析结果检测METTL3对肺癌细胞生物学功能的影响；最后，结合sh-METTL3稳转A549细胞和B(a)P 16HBE的 m6A 测序结果，对差异化表达和 m6A 水平改变的 lncRNA 进行筛选，应用qRT-PCR技术进一步验证测序结果的准确性。
研究结果
1. TCGA肺癌相关lncRNA筛选
通过对TCGA中肺癌患者的数据分析，分别绘制出肺腺癌和肺鳞癌ceRNA调控网络。其中肺腺癌中共有21种关键lncRNA与临床特征之间存在相关性，肺鳞癌中共有25种关键lncRNA与临床特征之间存在相关性。进一步结合临床特征分析和可能参与的肺癌相关通路对肺腺癌和肺鳞癌中表达趋势一致的17种lncRNA进行分析，结果发现：7种lncRNA (AFAP1-AS1、CHIAP2、DGCR5、FER1L4、LINC00472、LINC00961和MGC27382)与肺癌的分期、转移等重要临床特征相关，并参与肺癌相关的GO功能和KEGG信号通路。GEO数据库的肺癌人群中测序结果分析显示，这7种关键候选lncRNA表达与TCGA数据分析结果相一致。经单变量和多变量Cox比例风险回归分析结果显示：肺腺癌和肺鳞癌中分别有4种和2种lncRNA与总体预后相关。随后通过上述lncRNA分别构建肺腺癌和肺鳞癌的预后风险模型，综合分析提示，风险评分可作为肺腺癌和肺鳞癌的单独预后指标，并具有较高的预后诊断价值。
2. 中国汉族肺癌人群关键lncRNA生物标志筛选
100对肺癌患者组织qRT-PCR结果显示，CHIAP2、LINC00472、LINC00961和 MGC27382 在肺癌组织中显著下调（P<0.05），而 AFAP1-AS1、DGCR5 和FER1L4在肺癌组织中显著上调（P<0.05）。AFAP1-AS1和LINC00472与病理类型显著相关。7 种 lncRNA 均与肺癌发病风险之间存在相关性（P<0.05），其中AFAP1-AS1、DGCR5 和 FER1L4 表达水平与肺癌发病风险呈正相关关系；CHIAP2、LINC00472、LINC00961和MGC27382表达水平与肺癌发病风险呈负相关。肺癌组织结果提示，7种lncRNA与肺癌的发生发展之间存在密切相关性，具有更高的机制研究价值。148例肺癌病人血清及165例健康对照人群血清qRT-PCR 结果显示，肺癌人群中的 CHIAP2、LINC00961、FER1L4、SFTA1P 和LINC00312 均显著性下调（P<0.05），其中 CHIAP2、LINC00961、SFTA1P 和LINC00312的表达水平与肺癌组织表达水平相符。lncRNA表达水平均与肺癌的发病风险之间存在显著相关性（P<0.05），且与肺癌发病风险呈负相关。联合ROC曲线分析结果发现，CHIAP2、LINC00961、SFTA1P和LINC00312具有较高的单独诊断价值和联合诊断价值（AUC=0.81），可能成为肺癌潜在的诊断潜在生物标志物。
3. LINC00961对肺癌生物学功能影响及机制研究
通过数据库分析和人群病例对照研究发现，LINC00961在肺癌组织和血清中都具有重要的诊断价值。生物信息学分析提示，LINC00961参与了多种肺癌相关调控通路，因此对其进一步开展功能和机制探讨。qRT-PCR结果显示：LINC00961在 A549 细胞和 B(a)P 16HBE 细胞中表达水平均下调。CCK-8 增殖实验显示， LINC00961可明显抑制A549细胞的增殖作用（P<0.05）。流式细胞术实验结果显示，LINC00961过表达可显著增加凋亡率（P<0.05）。划痕实验和Transwell实验结果显示， LINC00961 过表达的 A549 细胞的迁移和侵袭能力显著降低（P<0.05）。LINC00961 双荧光素酶报告基因检测提示，5 种 miRNA 可能与LINC00961 直接结合。qRT-PCR 和细胞回复实验结果显示：LINC00961 可能通过靶向调控miR-19a-3p、miR-19b-3p和miR-125b-5p影响肺癌的发生发展过程。经Western Blot技术检测后，蛋白表达结果显示，LINC00961稳定转染组中PI3K-AKT、MAPK和mTOR信号通路中的多种关键蛋白表达量明显降低（P<0.05）。裸鼠荷瘤实验结果显示：LINC00961 稳定转染组 A549 细胞成瘤体积显著减小（P<0.05）。Western Blot结果显示：LINC00961通过调控PI3K-AKT、MAPK和mTOR信号通路影响肿瘤生长。
4. m6A RNA甲基化调控lncRNA对肺癌生物学功能影响
m6A水平检测结果显示，A549细胞和B(a)P 16HBE细胞的m6A水平均显著升高，说明m6A RNA甲基化参与了肺癌的发生发展并起关键作用。qRT-PCR结果显示：A549细胞中METTL3的表达水平上调3.74倍，B(a)P 16HBE细胞中METTL3 的表达水平上调 2.81 倍。sh-METTL3 稳定转染 A549 细胞的 MeRIP-seq测序结果显示，共有29,840种基因表达水平发生改变，其中共有5,866种基因的表达水平具有显著性差异（P<0.05）；7,974种基因的m6A水平改变。联合分析结果显示，共有569种lncRNA的表达水平和m6A水平发生改变。细胞功能学实验结果显示：METTL3下调可显著增加细胞凋亡，降低细胞增殖、侵袭和迁移能力。经qRT-PCR检测结果显示，sh-METTL3稳转A549细胞中7种lncRNA （GABPB1-AS1、LINC00662、LINC01184、SNHG15、ZFAS1、MIR4435-2HG和PVT1）表达均下调，与MeRIP-seq测序结果相符。
研究结论
1. 通过对TCGA中肺癌患者的数据分析并构建ceRNA网络发现，共有29种和83种关键lncRNA参与肺腺癌和肺鳞癌ceRNA网络调控。其中共有17种关键 lncRNA 在肺腺癌和肺鳞癌中表达一致。进一步分析发现，AFAP1-AS1、CHIAP2、DGCR5、FER1L4、LINC00472、LINC00961和MGC27382与肺癌临床特征密切相关，并参与肺癌相关的通路。风险评分可作为肺腺癌和肺鳞癌的单独预后指标，并具有较高的预后诊断价值。
2. 通过对关键候选 lncRNA 在肺癌人群中的病例对照研究结合数据库分析结果发现，AFAP1-AS1、CHIAP2、DGCR5、FER1L4、LINC00472、LINC00961和 MGC27382 与肺癌的发病风险有密切相关性。结合肺癌血清和肺癌组织的表达结果分析发现，CHIAP2、LINC00961、SFTA1P和LINC00312具有较高的单独诊断价值和联合诊断价值，可成为肺癌潜在的诊断生物标志物。
3. LINC00961在肺癌A549细胞和B(a)P 16HBE细胞中表达均显著降低。过表达LINC00961可显著抑制A549细胞的增殖、促进凋亡、降低迁移、侵袭和抑制肿瘤形成。双荧光素酶报告基因检测、qRT-PCR、细胞回复实验和Western blot实验结果显示，LINC00961可能通过靶向调控miR-19a-3p、miR-19b-3p和miR-125b-5p调控PI3K-AKT、MAPK和mTOR信号通路进而影响肺癌的发生发展。
4. MeRIP-seq测序结果显示，METTL3下调m6A水平改变过程中，共有569种 lncRNA 表达水平发生改变。结合生物信息分析、生物学功能研究和关键lncRNA表达水平分析结果，提示m6A RNA甲基化可调控lncRNA影响肺癌细胞的生物学功能，在肺癌发生发展过程中起到重要作用。MeRIP-seq测序结果为肺癌发生发展过程中更深入的机制学探讨和生物标志物的发现提供了更有效的线索。
综上，本论文研究通过大数据分析筛选从而缩小研究范围，为后续的实验研究提供基础和参考，增加后续研究可靠性、准确性以及更高的针对性。最终为探索肺癌中发挥关键生物学作用的lncRNA分子提供线索，从而为肺癌的三级预防以及环境暴露健康评估提供可靠地理论依据。