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动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)导致的心血管疾病(cardiovascular diseases,CVDs)已经成为威胁人类健康的主要死亡病因之一,因此,寻找有效的AS防治措施是降低CVDs发病率和死亡率的重要策略。AS的发生与固有免疫反应密切相关,其起始于内皮损伤,而炎症反应贯穿于AS各个阶段;并且近年来研究报道细胞焦亡(pyroptosis)作为固有免疫的重要部分,参与了AS的进程并影响斑块的稳定性,因此,减轻血管内皮细胞炎性死亡(细胞焦亡)成为AS的防治重点。另一方面,NLRP3(NOD-like receptor protein 3)炎性体作为固有免疫的受体或感受器,他的活化将激活半胱天冬酶-1(caspase-1)依赖的细胞焦亡,从而起始AS的发生发展。另外,研究证实线粒体功能紊乱及线粒体活性氧(mitochondrial reactive oxygen species,mtROS)是NLRP3炎性体活化的关键。因此,抑制血管内皮细胞mt ROS产生可改善NLRP3炎性体调控的血管内皮细胞焦亡,从而防治AS的发生发展。天然黄酮类化合物二氢杨梅素(dihydromyricetin,DHM)在藤茶、乌墨、枳椇子等药食两用植物中含量丰富,具有抗氧化、抗炎、保肝等多种生物学活性。本实验室前期研究证实DHM能显著改善内皮氧化损伤,但其作用机制与靶点尚未明确。并且,DHM能否通过Nrf2信号通路调节血管内皮细胞ROS水平进而抑制血管内皮细胞焦亡,未见相关报道。因此,深入研究DHM对血管内皮细胞焦亡的改善作用及其分子机制对于AS的防治具有潜在的应用价值,同时也将为AS的药物研发提供新的理论依据。本研究利用原代培养的人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)为研究对象,运用si RNA转染、荧光显微镜观察、ELISA、免疫印迹、流式细胞分析等实验技术,研究了棕榈酸(palmitic acid,PA)对HUVECs细胞焦亡的作用,并进一步研究了NLRP3炎性体及mtROS在PA诱导HUVECs细胞焦亡中的作用。另一方面,研究了DHM对PA诱导的HUVECs细胞焦亡的影响,并深入探讨了Nrf2相关信号通路在DHM调节NLRP3炎性体活化及细胞焦亡中的作用及机制。全文主要实验结果及结论如下:1.PA可诱导血管内皮细胞焦亡。研究发现,PA明显导致血管内皮细胞损伤(降低细胞活力和促进LDH释放),破坏细胞胞膜完整性,并促进caspase-1活化体(Casp1p20)、IL-1β、ICAM-1的表达,以及促炎症因子IL-1β的成熟及分泌。而采用caspase-1抑制剂处理之后,PA对血管内皮细胞相关损伤作用被抑制。结果表明,PA能够诱导caspase-1依赖的血管内皮细胞焦亡。2.NLRP3炎性体活化是PA诱导血管内皮细胞焦亡所必需的。PA能以剂量依赖的方式增加NLRP3蛋白的表达。NLRP3被si RNA或特异性抑制剂(MCC950)抑制后,PA诱导细胞焦亡的作用被显著削弱。结果表明,PA通过活化NLRP3炎性体诱导了血管内皮细胞焦亡。3.PA通过诱导过量mtROS导致NLRP3炎性体活化进而触发细胞焦亡。PA能够显著增加血管内皮细胞ROS及mtROS的产生。而使用mtROS清除剂(Mito-TEMPO或NAC)处理之后,PA诱导的NLRP3炎性体及细胞焦亡作用被显著抑制。结果表明,mt ROS在PA诱导血管内皮细胞NLRP3炎性体活化及细胞焦亡中发挥重要作用。4.DHM能明显改善PA诱导的血管内皮细胞焦亡。主要表现在DHM能明显改善血管内皮细胞活力及细胞膜完整性,降低LDH、IL-1β释放,并抑制NLRP3、Casp1p20、IL-1β、ICAM-1蛋白表达。5.DHM通过调控Nrf2信号通路改善PA诱导的血管内皮细胞焦亡。DHM能剂量依赖地促进Nrf2及HO-1、NQO1的表达,并显著降低血管内皮细胞ROS及mtROS的水平。采用si RNA技术沉默Nrf2基因表达后,DHM对血管内皮细胞焦亡的改善作用被显著抑制。结果表明,Nrf2信号通路在介导DHM抑制PA诱导的血管内皮细胞NLRP3炎性体活化及细胞焦亡中发挥了重要作用。