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自1898年Gluck等首次将自体静脉用于动脉重建以来,自体静脉移植越来越多地被用于临床,迄今仍是修复肢体动脉缺损和冠状动脉旁路手术的主要方法,但常因内膜增生、再狭窄等原因影响远期疗效,Raja报道术后10年通畅率不足50%,因此有效预防移植静脉移植后内膜增生和再狭窄一直是大量的骨外科、血管外科、心脏外科学者研究的热点。移植静脉发生内膜增生是为了适应环境改变而发生的结构性重塑形,病理过程涉及到血栓形成,内皮细胞的免疫激活,白细胞的粘附、浸润,血管平滑肌细胞的迁移、增殖和凋亡,细胞外基质的形成和迁移,各种因子的激活和信号传导等机制,是一个受多种因素影响、多因子和多基因参与、多种机制调控的连续变化的病理过程,机制非常复杂,因此从根本上彻底阻止移植静脉再狭窄的发生至今仍是一个亟待解决的难题。内膜增生是移植静脉发生再狭窄最根本和最主要的病理变化,因此减轻移植静脉内膜的过度增生是预防移植静脉再狭窄的关键,基于此我们设计本课题,通过实验研究探讨以下三个问题:1、局部应用5-氟尿嘧啶对移植静脉内膜增生的影响;2、单层和双层自体静脉外支架对移植静脉内膜增生的影响;3、抑制外周组织粘连对移植静脉内膜增生的影响。第一部分局部应用5-氟尿嘧啶抑制移植静脉内膜增生的实验研究平滑肌细胞的过度增殖、迁移是移植静脉发生内膜增生最关键的机制,因此抑制平滑肌细胞的过度增殖、迁移,诱导平滑肌细胞凋亡,合理地调控血管的重构,是预防移植静脉内膜增生和再狭窄最直接有效的途径。5-氟尿嘧啶(5-FU)是一种嘧啶类的抗代谢药物,可以通过干扰DNA合成的途径抑制细胞增殖,诱导细胞凋亡,局部应用安全性高。Cragg研究发现5-氟尿嘧啶对体外培养的平滑肌细胞增殖有明显抑制作用。基于此,我们建立家兔自体颈外静脉-颈总动脉模型,通过实验动物验证局部应用5-氟尿嘧啶是否能够抑制在体移植静脉平滑肌细胞增殖和诱导平滑肌细胞凋亡,从而调控血管的重构,预防移植静脉再狭窄的发生。目的:探讨局部应用5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil, 5-FU)对动脉缺损静脉移植后内膜增生的影响。方法:选用64只5月龄雄性新西兰大白兔,体重2.8~3.0kg,随机分为A、B、C、D四组(n=16)。切取右侧颈外静脉3cm,游离左侧颈总动脉,中间切除长约1cm,建立动脉缺损模型,将切取静脉远近端倒置后用9-0无损伤缝线端端吻合于动脉缺损,吻合结束后A组、B组、C组动物分别用于50mg/ml、25mg/ml、12.5mg/ml的5-氟尿嘧啶中浸泡的脑棉(大小为12mm×30mm×1mm)完全包裹移植静脉外膜方式给药,共5次,每次1min,D组用生理盐水取代5-氟尿嘧啶同样方法处理。分别于术后1、2、4、6周切取移植静脉,行HE染色、Masson染色观察移植静脉管壁组织学变化,PCNA免疫组化染色、TUNEL标记染色观察移植静脉平滑肌细胞增殖和凋亡情况,透射电镜观察细胞超微结构变化。结果:HE染色、Masson染色观察到:术后1、2、4、6周A组、B组移植静脉内膜增厚均明显小于C组和D组,PCNA免疫组化染色和TUNEL法标记染色观察到:术后1、2、4周A组、B组增殖细胞少于C组和D组,术后1、2周内膜、中膜凋亡细胞A组和B组明显多于C组和D组。内膜厚度、内膜增生程度、管腔狭窄程度结果分别为:1周A组12.69±1.68μm,0.73±0.05,0.025±0.003;B组17.52±2.01μm,0.86±0.06,0.027±0.004;C组21.92±1.85μm,1.06±0.09,0.036±0.006;D组26.45±3.86μm,1.18±0.08,0.041±0.005。2周A组24.61±2.91μm,0.86±0.06,0.047±0.003;B组37.28±2.78μm,1.17±0.09,0.060±0.004;C组46.52±2.25μm,1.41±0.08,0.073±0.003;D组52.07±3.29μm,1.45±0.05,0.081±0.006。4周A组61.09±6.84μm,1.38±0.08,0.106±0.007;B组63.61±8.25μm,1.40±0.07,0.107±0.010;C组80.04±7.65μm,1.64±0.07,0.129±0.011;D组84.45±9.39μm,1.68±0.10,0.138±0.014。6周A组65.27±5.25μm,1.46±0.07,0.113±0.005;B组65.82±7.12μm,1.45±0.05,0.112±0.011;C组84.45±6.39μm,1.69±0.09,0.135±0.007;D组87.27±8.96μm,1.76±0.05,0.140±0.012。均为A组、B组小于C组和D组(P<0.05)。内膜的增殖指数、凋亡指数和外膜的增殖指数、凋亡指数结果分别为:1周A组4.83±1.96,30.51±4.01,14.61±2.17,9.23±1.40;B组8.01±2.18,29.27±5.18,20.25±3.18,6.93±1.05;C组9.09±1.27,19.21±3.16,26.80±3.13,3.89±1.11;D组12.25±2.13,28.71±4.17,19.01±4.12,3.83±1.34。2周A组18.92±3.73,36.16±2.27,22.31±3.94,10.72±2.32;B组19.16±3.26,32.41±3.74 , 30.51±4.01 , 5.13±2.22; C组25.97±2.17 , 29.24±2.11 ,37.81±4.50,5.94±1.79;D组27.06±2.91,27.15±2.51,42.71±3.60,5.21±1.91。4周A组10.17±1.21,11.73±3.21,20.00±3.16,5.19±1.83;B组11.18±2.01,11.23±2.15,21.13±2.62,4.99±1.41;C组15.01±2.03,11.04±2.84,24.64±2.98,4.15±2.31;D组15.96±2.44,12.21±3.68,28.70±2.08,4.86±1.69。6周A组6.67±2.10,5.69±2.31,2.51±1.53,3.84±1.41;B组6.67±1.81,5.04±1.71,2.47±1.51,3.53±1.34;C组6.88±2.01,5.99±2.13,3.40±0.98,3.74±1.03;D组8.21±2.27,6.01±2.03,3.28±1.09,3.64±1.08。术后1、2、4周的细胞增殖指数均为A组、B组小于C组和D组(P<0.05),术后1、2周内膜、中膜细胞凋亡指数A组和B组均大于C组和D组(P<0.05)。透射电镜观察到A组、B组相对于C组和D组粗面内质网、高尔基体、核糖体等合成细胞器含量明显减少。结论:局部应用5-FU可抑制移植静脉平滑肌细胞增殖,诱导术后早期平滑肌细胞凋亡,有效地减轻内膜增生,降低移植静脉管腔再狭窄程度。第二部分自体静脉外支架对移植静脉内膜增生影响的实验研究1963年,Parsonne等首先报道了于移植静脉周围应用外支架(external stent)能够减轻移植静脉的内膜增生,有效地预防移植静脉狭窄,之后许多学者通过实验研究证实应用外支架是一种很有前景的预防移植静脉狭窄的措施。外支架的作用是对抗移植静脉移植后的早期扩张,通过刺激新生外膜形成或直接对抗作用使移植静脉管腔内的血流动力学特性更加接近动脉,从而减少因血流动力学改变所引发的一系列病理改变。目前应用的外支架多为人工合成材料,植入体内可引发慢性炎症、局部感染、静脉外膜纤维化等不良反应,而且其弹性和顺应性与动脉差异很大,因此并不能充分发挥减少移植静脉血流动力学改变的作用。我们选用自体相容性好、弹性和顺应性与动脉相近的自体静脉作为移植静脉的外支架,在移植静脉外周放置单层和双层自体静脉外支架,通过动物实验观察自体静脉外支架能否对抗移植静脉的早期扩张,抑制平滑肌细胞增生,预防移植静脉再狭窄的发生。目的:探讨自体静脉外支架对动脉缺损静脉移植后内膜增生的影响。方法:选用36只5月龄雄性新西兰大白兔,体重2.8~3.0kg,随机分为A组、B组和C组(n=12)。切取右侧颈外静脉6cm,等分为三段,远心段均用作移植静脉,B组以中段作为自体外支架,A组以近心段套叠中段做成双层自体外支架。游离左侧颈总动脉,中间切除长约0.5cm,建立动脉缺损模型,将移植静脉远近端倒置后吻合于动脉缺损,通血后行移植静脉外径测量。分别于术后2、4周切取移植静脉,行HE染色、Masson染色观察移植静脉管壁组织学变化,PCNA免疫组化染色观察移植静脉平滑肌细胞增殖情况。结果:通血后移植静脉直径A组1.62±0.31mm,B组2.21±0.40mm,C组2.65±0.58mm,A组<B组<C组(P<0.05)。术后2、4周HE染色、Masson染色、PCNA免疫组化染色观察到:A组、B组移植静脉内膜增厚均明显小于C组,A组、B组内膜和中膜的增殖细胞均少于C组。内膜厚度、内膜增生程度、管腔狭窄程度结果分别为:2周A组35.13±3.24μm,0.88±0.03,0.046±0.004;B组44.53±3.55μm,1.08±0.02,0.058±0.005;C组51.62±4.72μm,1.21±0.04,0.068±0.007。4周A组51.73±6.08μm,1.01±0.07,0.076±0.008;B组69.29±6.33μm,1.32±0.08,0.101±0.009;C组85.00±7.36μm,1.55±0.03,0.134±0.003。术后2、4周的内膜厚度、内膜增生程度、管腔狭窄程度均为A组<B组<C组(P<0.05)。内膜、中膜的增殖指数结果分别为:2周A组16.98±3.96,28.39±6.02;B组24.07±4.13,36.41±6.93;C组29.90±4.68,48.45±5.60。4周A组6.84±1.98,15.65±5.12;B组11.01±2.61,23.31±4.30;C组14.96±4.14,29.64±4.15。术后2、4周的内膜和中膜增殖指数均为A组<B组<C组(P<0.05)。结论:双层自体静脉外支架可以有效地抑制移植静脉内膜增生,减轻移植静脉管腔再狭窄程度。第三部分抑制外周组织粘连对移植静脉内膜增生影响的实验研究移植静脉植入后均与外周组织间存在明显的粘连,粘连机制是移植静脉外膜滋养血管长入、从外周组织获得血运的途径。如果采取措施阻止外周粘连,阻止外膜滋养血管长入,屏蔽移植静脉从周围组织获得血运,可能导致内膜缺血,而内膜缺血促进促有丝分裂原的产生,是内膜增生的重要原因。Fogelstrand和Zhang等学者通过动物实验研究发现外周组织来源的平滑肌细胞也是导致移植静脉内膜增生的重要细胞来源,外周组织源性平滑肌细胞通过外周组织粘连迁移至移植静脉,参与内膜增生的形成,阻断外周组织的粘连可以抑制内膜增生。因此,阻止外周组织粘连对移植静脉内膜增生可以产生两种相反的作用机制,究竟哪一种机制占主导地位,抑制周围组织粘连将对内膜增生产生怎样的影响是一个需要探究的课题。透明质酸钠局部应用可以抑制粘连的发生,而且透明质酸钠为液性,局部应用后不通过改变移植静脉的生物力学机制影响内膜增生。因此,我们设计采用移植静脉周围应用透明质酸钠的方法抑制移植静脉周围组织粘连,与常规移植静脉对照,揭示其抑制外周组织粘连对移植静脉平滑肌细胞增殖、细胞因子(PDGF)的表达和分布以及对内膜增生的影响。目的:探讨抑制外周组织粘连对移植静脉平滑肌细胞增殖、细胞因子(PDFG)的表达和分布以及对内膜增生的影响。方法:选用24只5月龄雄性新西兰大白兔,体重2.8~3.0kg,随机分为A组、B组(n=12)。切取右侧颈外静脉3cm,游离左侧颈总动脉,中间切除长约1cm,建立动脉缺损模型,将切取静脉远近端倒置后用9-0无损伤缝线端端吻合于动脉缺损,吻合结束后A组动物用透明质酸钠凝胶0.2ml涂布于移植静脉外膜及两个吻合口。分别于术后1、2、4周行移植静脉切取前肉眼观察,切取移植静脉后行HE染色、Masson染色观察移植静脉管壁组织学变化,PCNA免疫组化染色、PDGF免疫组织化学染色观察移植静脉平滑肌细胞增殖和PDFG的表达、分布情况。结果:术后1、2、4周肉眼观察B组移植静脉周围均有明显粘连,A组术后1、2周无粘连,术后4周有轻度粘连。HE染色、Masson染色、PCNA免疫组化染色和PDGF免疫组化染色观察到:术后2、4周A组移植静脉内膜厚度小于B组,术后1、2、4周A组增殖细胞均少于B组,术后1周A组外膜无PDGF阳性细胞,B组外膜内见阳性的炎性细胞;术后2、4周A组内膜、中膜和外膜PDGF阳性细胞均少于B组。内膜厚度、内膜增生程度、管腔狭窄程度结果分别为:1周A组25.51±3.93μm,1.18±0.07,0.041±0.005;B组26.18±4.16μm,1.19±0.09,0.042±0.006。2周A组44.27±2.53μm,1.22±0.06,0.062±0.003;B组50.99±3.76μm,1.40±0.03,0.078±0.004。4周A组69.85±6.76μm,1.49±0.07,0.114±0.009;B组84.43±6.41μm,1.69±0.09,0.137±0.007。术后2、4周A组的内膜厚度、内膜增生程度、管腔狭窄程度均小于B组(P<0.05)。内膜、中膜的增殖指数结果分别为:1周A组7.43±2.21,21.53±3.24;B组11.41±2.01,28.63±4.48。2周A组20.01±3.21,35.81±3.41;B组26.78±4.14,42.63±4.15。4周A组11.41±2.01,22.09±2.65;B组15.52±2.37,28.64±3.90。术后2、4周A组的内膜和中膜增殖指数均小于B组(P<0.05)。内膜、中膜外膜的PDGF表达率结果分别为:1周A组7.67±1.61,19.59±3.66,2.46±1.53;B组7.60±2.42,20.58±4.39,10.25±2.31。2周A组11.37±2.55,19.81±3.09,12.90±3.26;B组19.45±3.48,30.63±5.16,30.47±5.84。4周A组6.15±1.94,11.09±2.83,10.19±2.44;B组10.51±2.03,18.64±3.21,26.51±3.84。术后1周A组外膜PDGF表达率低于B组(P<0.05),术后2、4周A组的内膜、中膜和外膜PDGF表达率均小于B组(P<0.05)。结论:局部应用透明质酸钠可以有效地抑制移植静脉外周粘连的形成,并在一定程度上减轻内膜增生;抑制外周组织粘连并不加重移植静脉内膜增生和管腔狭窄。