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柠檬烯是一种重要的功能性单萜,在食品中作为香精香料添加剂被广泛使用,其含氧衍生物具更高经济价值。与传统化学方法相比,微生物转化反应条件温和,区域和立体选择性好,环境友好且获得的为“天然”产品。通过微生物转化,可以将柠檬烯转化为香气更浓,应用更为广泛的、商业价值更高的香芹醇、香芹酮、紫苏酸、α-松油醇等物质。本实验先利用SPME-GC-MS,分析检测了三株真菌尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum CICC41029)、指状青霉(Penicillium digitatum DSM62840)和青霉(Penicillium sp.)对柠檬烯的转化产物,以α-松油醇为目标产物,根据各个菌株微生物转化产物的种类和含量,选出最优转化菌株;然后对指状青霉(Penicillium digitatum DSM62840)转化柠檬烯为α-松油醇的过程进行条件优化并对转化过程中的酶进行了初步研究;最后采用i TRAQ技术对指状青霉(Penicillium digitatum DSM62840)对柠檬烯微生物转化不同时期(12h和0h)的蛋白表达做了比较,鉴定得到的差异蛋白为深入研究指状青霉(Penicillium digitatum DSM62840)对柠檬烯微生物转化的分子机制提供基础。主要结果如下:1.比较三株真菌尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum CICC41029)、指状青霉(Penicillium digitatum DSM62840)和青霉(Penicillium sp.)生物转化柠檬烯的产物,利用SPME-GC-MS固相微萃取-气相色谱-质谱连用的方法对发酵液进行检测,总共得到13种转化产物,其中薄荷烯酮、异薄荷烯酮、异佛尔酮为尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum CICC41029)所独有的产物,紫苏醇、紫苏醛为青霉(Penicillium sp.)所独有的产物,γ-松油烯、α-异松油烯、α-松油醇为指状青霉(Penicillium digitatum DSM62840)所独有的产物;1-对薄荷烯-9-醛为尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum CICC41029)和青霉(Penicillium sp.)所共有的产物,脱氢香芹酮、香芹醇为尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum CICC41029)和指状青霉(Penicillium digitatum DSM62840)所共有的产物,1,3,8-p-Menthatriene为青霉(Penicillium sp.)和指状青霉(Penicillium digitatum DSM62840)所共有的产物;3株真菌均能在柠檬烯2位进行氧化得到香芹酮。指状青霉(Penicillium digitatum DSM62840)可以在24h时生成202±14.7mg/L的α-松油醇,表现出良好的转化柠檬烯的能力。2.对指状青霉(Penicillium digitatum DSM62840)转化柠檬烯为α-松油醇的过程进行条件优化,分别研究不同指状青霉生长时期、底物浓度、共溶剂种类、温度、p H、转速等因素,得出最优转化条件,即在摇瓶培养中,先预培48小时,再加入20%的柠檬烯/乙醇溶液(柠檬烯终浓度为840mg/L),于24°C,150 rpm和p H 6.0条件下转化12 h。该条件下得到的α-松油醇浓度为833.93±18.67 mg/L,是优化之前(202±14.7mg/L)的4.1倍。实验显示该生物转化对温度和p H有较好的耐受性,8–32°C,p H 5–8对生物转化的影响均不大。3.对指状青霉(Penicillium digitatum DSM62840)转化柠檬烯为α-松油醇的微生物转化过程中的酶进行了初步研究,实验结果表明负责该生物转化的酶系具有对映体选择性,即P.digitatum DSM 62840不能将S-(-)-柠檬烯转化为S-(-)-α-松油醇,只能将R-(+)-柠檬烯转化为R-(+)-α-松油醇;该生物转化过程中的酶是可诱导的,当在指状青霉(Penicillium digitatum DSM62840)24小时预培养物中加入低剂量(84mg/L)的R-(+)-柠檬烯进行诱导时,α-松油醇的浓度提高50%;加入氧化酶抑制剂邻二氮杂菲和8-羟基喹啉后该生物反应均被抑制,说明该生物转化酶系可能为细胞色素P-450单加氧酶。4为了初步探讨指状青霉(Penicillium digitatum DSM62840)对柠檬烯微生物转化的机制,本研究采用i TRAQ技术对指状青霉柠檬烯微生物转化不同时期(12h和0h)的蛋白表达做了比较,共鉴定得到20373个肽段,3644个蛋白。在转化时间为12h的菌体中显著上调的蛋白有76个,下调蛋白有102个。对差异蛋白进行GO分析得知,这些蛋白质共参与11个生物过程,主要是代谢过程和细胞过程;大部分差异蛋白位于细胞和细胞部分中;分子功能主要为催化活性和结合。所有注释到的差异蛋白富集于79条代谢通路,其中10条具有显著性,主要为代谢途径和次级代谢产物的生物合成。这些差异蛋白为指状青霉对柠檬烯微生物转化的机制研究提供基础。