论文部分内容阅读
目的:阐明Cdk5介导Drp1蛋白调控线粒体功能在糖尿病视网膜病变（Diabetic Retinopathy,DR）中的作用机制;探究Drp1抑制剂Mdivi-1及Cdk5抑制剂Roscovitine通过调控线粒体功能影响糖尿病视网膜病变血管闭塞情况。方法:1.在探讨Drp1蛋白在DR线粒体功能障碍相关作用的研究中:（1）HRMECs分组后分别处于正常葡萄糖（5.5m M）、高渗组（5.5m M葡萄糖+20m M甘露醇）、高葡萄糖（30 m M）环境各培养3周,在高糖（30 m M）环境培养1周后细胞转染Drp1小干扰RNA,然后高糖（30 m M）条件下培养2周,以及在高糖（30 m M）培养1周后予以Drp1抑制剂Mdivi-1（25μM）处理后高糖（30m M）环境下培养2周。（2）透射电镜检测验证预测细胞内线粒体裂变情况。（3）实时荧光定量PCR技术检测各组HRMECs细胞中Drp1m RNA的表达水平。（4）检测Mdivi-1处理后每组细胞的细胞活力情况。（5）Western blot检测每一组细胞中Drp1蛋白的相对表达水平。（6）流式细胞技术检测每组细胞的ROS产生水平及细胞凋亡水平。（7）透射电镜观察每组细胞内线粒体裂变情况。2.在探讨Cdk5介导Drp1（ser616）磷酸化在DR“线粒体功能障碍”中的作用的研究中:（1）将HRMECs分别处于正常糖（5.5m M）、高糖（30 m M）培养3周,在正常糖（5.5m M）以及高糖（30 m M）环境下培养1周后予以Cdk5抑制剂Roscovitine（25μM）处理后接着高糖（30 m M）环境培养2周。（2）细胞活力检测Roscovitine处理后每组细胞活力情况。（3）Western blot检测每一组细胞中Cdk5蛋白以及Drp1（ser616）蛋白表达水平。（4）流式细胞技术检测每组细胞的ROS产生水平及细胞凋亡水平。（5）透射电镜观察每组细胞内线粒体裂变情况。3.胰岛β细胞选择性破坏剂链脲佐霉素（streptozotocin,STZ）腹腔内注射（注射浓度:60 mg/kg）建立SD雄性大鼠糖尿病模型后,将大鼠分组后予以正常大鼠以及糖尿病大鼠的两只眼球分别予以玻璃体注射Mdivi-1及Roscovitine（2.0μg/次/月）,Western blot检测各组大鼠视网膜组织Drp1、Drp1（ser616）、Cdk5表达,视网膜血管铺片PAS染色检测大鼠视网膜闭塞无细胞毛细血管数量。结果:（1）与正常浓度糖环境比较,高糖环境下,HRMECs胞内Drp1蛋白相对表达上升,胞内线粒体发生明显裂变。（2）与正常浓度糖环境比较,高糖环境下,HRMECs胞内ROS表达相对表达上升,凋亡细胞占比增加,两组之间差异较为显著（P＜0.05）;（3）与正常糖组（N）、高渗组（HM）比较,高糖组（HG）中Drp1m RNA的表达明显增高,分组之间差异较为显著（P＜0.05）;而与HG组相比较,细胞转染Drp1si RNA（HG+si RNA）后,Drp1 m RNA的相对表达有了明显下调,分组之间差异较为显著（P＜0.05）。N组未予Mdivi-1处理的组别细胞与予以Mdivi-1处理的组别细胞相比,细胞活力测定良好无明显降低,而HG组予以Mdivi-1处理的HRMECs与未予Mdivi-1处理的细胞相比,活力测定明显增高,分组之间差异较为显著（P＜0.05）。与HG相比,HG+Drp1si RNA、HG+Mdivi-1中Drp1蛋白的表达明显降低（P＜0.05）;与HG组相比,HG+Drp1si RNA、HG+Mdivi-1组ROS产生量与细胞凋亡率明显下降（P＜0.05）,予以Drp1降低处理后,HG环境下细胞内线粒体破裂情况减轻,线粒体肿胀面积明显降低,分组之间差异较为显著。（4）与正常糖组（N）比较,HG组中Drp1（ser616）以及Cdk5蛋白的表达明显增高,分组之间差异较为显著（P＜0.05）;N组未予Roscovitine处理的组别细胞与予以Roscovitine处理的组别细胞相比,细胞活力测定良好无明显降低,而HG组予以Roscovitine处理的HRMECs与未予Roscovitine处理的细胞相比,活力测定明显增高,分组之间差异较为显著（P＜0.05）。与HG组相比较,细胞予以Roscovitine（HG+Roscovitine）处理后,Drp1（ser616）表达随Cdk5的下降而降低,分组之间差异较为显著（P＜0.05）;与HG组相比,HG+Roscovitine组ROS产生量以及细胞凋亡率明显减少,分组之间差异较为显著（P＜0.05）。经过Cdk5表达抑制后,HG环境下细胞内线粒体破裂情况减轻,线粒体肿胀面积明显降低,分组之间差异较为显著（P＜0.05）。（5）相对于正常大鼠,糖尿病大鼠的视网膜组织中Drp1、Drp1（ser616）、Cdk5的表达显著增高,分组之间差异较为显著（P＜0.05）,可观察到闭塞的无细胞毛细血管数量显著增多,而给予Cdk5抑制剂Roscovitine后,Drp1（ser616）表达随Cdk5的下降而降低,且闭塞的无细胞毛细血管数量显著减少,分组之间差异较为显著（P＜0.05）。结论:（1）高糖环境下,Drp1调控HRMECs线粒体形态功能及细胞凋亡;（2）通过调控Drp1及Drp1（ser616）位点磷酸化可改善HRMECs线粒体形态功能及细胞凋亡;（3）Mdivi-1和Roscovitine可改善糖尿病大鼠的视网膜血管闭塞情况。