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食品中的重金属铅污染影响食品的品质和安全。铅具有神经毒性,损伤中枢神经系统,但其毒性机理还不完全清楚。自噬溶酶体通路是维持细胞生存与稳态的一种重要的分解代谢途径。异常的自噬溶酶体通路与人类很多疾病的发生都有紧密的联系。目前,铅对于自噬溶酶体通路的影响尚无系统的研究。目的:1.探究铅暴露对细胞自噬溶酶体通路的影响,并对这种影响的特征进行研究。2.探究铅暴露损伤细胞自噬溶酶体通路的可能机制,从自噬发生的整个过程全面的探究其损伤机制。方法:1.以神经元的模式细胞—PC12细胞作为研究对象,首先用MTT的方法检测不同浓度铅暴露对PC12细胞的毒性作用;2.Western Blot检测不同浓度铅暴露对自噬标记蛋白LC3蛋白的影响;3.以自噬激活剂雷帕霉素作阳性对照,通过Western Blot和GFP-LC3单荧光融合蛋白示踪检测铅暴露后细胞内自噬体数目的变化;4.检测铅暴露后细胞内SQSTM1/p62蛋白含量,判断铅暴露对细胞自噬流的影响;5.检测铅暴露对自噬起始蛋白Beclin1蛋白含量的影响,并用引入自噬起始抑制剂3-MA和敲低细胞内ATG5的表达这两种方法,研究铅暴露对自噬体形成过程的影响;6.通过GFP-LC3与LAMP1荧光共定位的方法研究铅暴露对自噬体与溶酶体融合过程的影响,并检测参与自噬体与溶酶体膜融合有关蛋白m RNA水平;7.检测铅暴露后溶酶体的标记蛋白LAMP1蛋白含量变化,并用Lyso Tracker Red染色和Lyso Sensor Green DND-189染色标记铅暴露后细胞内溶酶体数量以及p H。结果:1.铅暴露会显著影响PC12细胞的存活率,且这种影响是呈剂量依赖的;2.铅暴露后细胞内LC3-II蛋白含量会显著增加,综合GFP-LC3单荧光融合蛋白示踪实验结果表明铅暴露导致细胞内自噬体增多;3.铅暴露损伤了细胞的自噬流,这种损伤是时间依赖的,并且在去铅培养12h后会恢复;4.铅暴露并不影响自噬活性和自噬体的形成过程;5.铅暴露损伤了细胞内自噬体与溶酶体融合过程,但这种损伤与SNARE蛋白参与的膜融合过程可能无关;6.铅暴露降低了细胞内溶酶体的数量并损伤了其功能。结论:本课题研究结果表明铅暴露损伤了溶酶体的数量及功能,引起自噬体与溶酶体的融合过程受阻,进而阻断细胞的自噬流。自噬体因无法正常降解而堆积在细胞内,造成细胞内代谢紊乱。铅暴露导致的自噬溶酶体通路损伤可能参与了铅对细胞的神经毒性作用。