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目的:幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H.pylori)是引起慢性胃炎和胃十二指肠溃疡的致病因子,流行病学和动物实验证实H.pylori慢性感染是导致胃癌的重要危险因素。CagA蛋白作为最重要的H.pylori毒力因子之一,被认为是一种细菌性致癌蛋白,在胃癌的发生、发展中具有重要作用。本研究在已证实CagA与YWHAE可相互作用的前提下,深入研究与YWHAE结合的CagA区段及其对NF-κB激活的影响,旨在进一步阐明CagA的致病机制。方法:1与YWHAE相互作用的CagA区段的确定1.1酵母双杂交检测与YWHAE相互作用的CagA区段(1)CagA分段蛋白酵母双杂交诱饵质粒的构建与反式激活功能的检验:根据CagA蛋白的三级结构特征,将cag A全基因序列分为三段:N(4-765bp)、M(766-2613bp)及C(2614-3441bp),将N、M、N+M(4-2613bp)及C片段分别克隆入酵母双杂交诱饵载体上,转化入酵母AH109菌株,用Western Blot检测蛋白表达情况,并用滤纸法定性检测和液相分析法定量检测CagA分段蛋白是否具有反式激活GAL4反应元件的作用。(2)酵母一对一双杂交检测与YWHAE相互作用的CagA区段:将CagA分段蛋白的诱饵质粒分别与YWHAE的猎物质粒一对一交配实验,用β-gal定性检测法和液相分析法定量检测法检测杂交产物,筛查出CagA与YWHAE相互作用的位点。1.2免疫共沉淀确定与YWHAE相互作用的CagA区段:构建带有Myc标签的YWHAE真核表达载体,Western Blot检测蛋白表达情况。将本课题组已构建好的带FLAG标签的CagA及其分段蛋白表达载体分别与YWHAE表达载体共转染COS-7细胞,用anti-FLAG抗体结合CagA及其分段蛋白,用anti-Myc抗体检测免疫沉淀后的YWHAE,确定在哺乳动物细胞内与YWHAE相互作用的CagA区段。2与YWHAE相互作用的CagA区段对NF-κB激活的影响(1)双荧光素酶报告基因检测与YWHAE相互作用的CagA区段对NF-κB激活的影响:将CagA及其互作区段蛋白表达载体或与YWHAE表达载体分别转染入AGS细胞,以p NF-κB-luc为报告质粒,p RL-TK为内参。检测萤火虫荧光素酶活性及海肾荧光素酶活性,以海肾荧光素酶活性为内参,平衡校正萤火虫荧光素酶值。(2)慢病毒介导YWHAE基因沉默的AGS稳定细胞株的构建:构建5个重组慢病毒p LL3.7-YWHAE-sh RNA表达载体,转染293-T细胞,进行病毒包装,感染AGS细胞,用最低致死量的Puromycine筛选细胞,Western Blot验证沉默效果,筛选出YWHAE沉默效果最好的细胞株进行后续实验。(3)干扰回复实验:利用重叠延伸PCR法,构建YWHAE点突变质粒pc DNA3.1-myc-YWHAEm,Western Blot检测蛋白表达情况。将pc DNA3.1-myc-YWHAEm转染入YWHAE基因沉默的AGS稳定细胞株中,Western Blot检测YWHAE蛋白沉默回复情况。(4)YWHAE沉默对CagA互作区段激活NF-κB的影响:将CagA及其互作区段蛋白表达载体分别转染入YWHAE基因沉默的AGS稳定细胞株中,用双荧光素酶报告基因检测NF-κB的激活。(5)双荧光素酶报告基因检测CagA和CagA-C激活NF-κB的强弱:将等摩尔数的CagA和CagA-C表达载体或与YWHAE表达载体分别转染AGS细胞,用双荧光素酶报告基因检测NF-κB的活性。结果:1与YWHAE相互作用的CagA区段的确定(1)酵母双杂交检测与YWHAE相互作用的CagA区段:CagA分段蛋白的酵母双杂交诱饵质粒可在酵母菌株内表达,且不具有反式激活GAL4反应元件的作用。酵母一对一交配实验结果显示,CagA、CagA-N、CagA-N+M、CagA-C诱饵蛋白可与猎物蛋白YWHAE在酵母中相互作用激活GAL4反应元件。(2)免疫共沉淀检测与YWHAE相互作用的CagA区段:结果显示,CagA、CagA-N和CagA-C可沉淀外源性YWHAE,证实了在哺乳动物细胞内,与YWHAE相互作用的CagA区段为CagA-N段和CagA-C段。2 CagA-N和CagA-C对NF-κB激活的影响(1)双荧光素酶报告基因检测结果显示,CagA-N和CagA-C均可显著激活NF-κB,且相同剂量下,CagA-C的激活效应比CagA-N强;CagA-N和CagA-C与YWHAE共转染后,NF-κB的活性增加更为显著。(2)慢病毒感染AGS细胞后,用最低致死量的Puromycine筛选细胞,Western Blot验证结果显示,p LL3.7-si NC包装成的慢病毒对细胞内源YWHAE无明显影响,p LL3.7-si YWHAE-5包装成的慢病毒沉默YWHAE的效果最好,可用于后续实验。(3)干扰回复实验结果显示,AGS-si YWHAE细胞转染pc DNA3.1-myc-YWHAEm后,YWHAE表达明显上调,与AGS-si NC细胞内源性YWHAE相近。(4)YWHAE沉默对CagA-N或CagA-C激活NF-κB的影响:当内源性YWHAE受到抑制时,CagA-N和CagA-C对NF-κB的激活作用无显著影响。(5)双荧光素酶报告基因检测CagA和CagA-C激活NF-κB的强弱:结果显示,CagA对NF-κB的激活作用显著强于等摩尔数的CagA-C,且CagA或CagA-C与YWHAE共转染组NF-κB活性均显著高于CagA、CagA-C和YWHAE单转染组。结论:CagA-N和CagA-C,即CagA的N-末端结构域I和C-末端可与YWHAE相互作用激活NF-κB,且CagA-C的激活效应显著强于CagA-N,但弱于CagA。