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缺血/低氧预适应(Ischemic/hypoxicpreconditioning,I/HPC)是一种内源性保护机制，即亚致死性缺血/低氧刺激可诱发器官组织产生对严重缺血/低氧所致损伤的耐受。由I/HPC引起的组织保护机制为临床防治缺血/低氧性脑损伤提供了新策略，但其确切的形成机制尚不清楚。目前对脑I/HPC机制的探讨，尤其是对参与调节I/HPC的信号传导系统的研究是近年国内外低氧研究领域的热点。丝裂原激活蛋白激酶(MAPKs)家族主要包括三大成员，即细胞外信号调节激酶(ERKs)、c-Jun氨基末端激酶或应激激活的蛋白激酶(JNKs/SAPKs)和蛋白38激酶(p38)。ERKs有5个成员(ERK1-5)，其中ERK1/2通路是迄今为止研究最为活跃的信号传导通路。ERK1/2的信号转导通路则为：Ras-Raf1-MEK1/2-ERK1/2。被激活的ERK1/2可进一步激活其它激酶或转录因子，影响基因表达，从而在细胞增殖、分化、衰老和凋亡等生理或病理过程中发挥重要的作用。ERK1/2在缺血再灌注所致组织损伤中的作用虽有部分研究报道，但关于ERK1/2在脑I/HPC发生发展过程中的作用目前尚未见报道。
为了探讨脑I/HPC形成的细胞分子机制，本课题组建立了自然低氧(autohypoxia)诱导的“小鼠整体I/HPC模型”。利用这一模型，我们已证明，蛋白激酶C(PKCs)家族成员中的cPKCβⅡ和γ，以及nPKCε在脑I/HPC早期形成过程中起着重要作用。cPKCβⅡ可激活ERK1/2；nPKCε不仅能激活ERK1/2，还可激活MAPKs的其它通路。据此，本课题拟通过观察重复性低氧对小鼠大脑皮层和海马组织内ERK1/2磷酸化水平、蛋白表达量以及亚细胞分布的影响，探讨ERK1/2在脑I/HPC发生发展过程中的作用。
实验在室温20-22℃下进行，实验动物为成年(12-14周，体重18-22g)雄性BALB/c小鼠，利用已建立的自然低氧(auto-hypoxia)诱导的“小鼠整体I/HPC模型”，来模拟临床上的“窒息”过程。即成年健康BALB/C小鼠随机分为正常对照组(H0)、低氧暴露1次(H1)、重复性低氧2、3和4次(早期低氧预适应，H2-H4)，以及重复性低氧5、6次(4次重复性低氧小鼠恢复24h后，再进行第5和6次低氧刺激，即H5和H6为延迟性低氧预适应)等7组。低氧结束后，小鼠被断头处死，迅速分离前部大脑皮层和海马组织，样品在-70℃冰箱内冻存，待检测ERK1/2磷酸化水平、蛋白表达量，以及亚细胞分布情况。为了在离体水平上检测持续性低氧对ERK1/2激活状态的影响，我们利用离体培养的人类神经母细胞瘤细胞系-SH-SY5Y细胞，观察了不同时间的持续性低氧刺激下，SH-SY5Y细胞内ERK1/2磷酸化水平的变化。将SY5Y细胞接种于含10％胎牛血清的DMEM培养基的培养瓶中，并置于37℃、95％空气/5％CO2、饱和湿度的CO2孵箱内培养。在进行SH-SY5Y细胞持续低氧暴露时，气体成分为1％O2/5％CO2/94％N2，而低氧刺激时间则分别为：0、6、12h。低氧刺激结束后，用冰浴的PBS洗三次，然后将收集的细胞冻存于-70℃，待检测ERK1/2磷酸化水平。
实验应用蛋白凝胶电泳(SDS-PAGE)、蛋白印迹(Western-blot)和免疫组织化学(Immunostaining)等生化技术，并结合GelDoc凝胶成像系统，定量分析小鼠脑组织和离体培养SH-SY5Y细胞内ERK1/2磷酸化水平、蛋白表达量，以及亚细胞分布情况。所有实验数据均通过OnewayANOVA统计学检验，以均数±标准误(x±S.E.)表示，并以Bonferroni法作显著性比较，其中p＜0.05具有显著性。实验结果如下：
(1)在脑早期低氧预适应形成过程中，随低氧暴露次数(H1-H4)增加，小鼠皮层组织和海马组织内ERK1/2磷酸化水平逐渐降低。半定量分析结果显示，与H0相比，H1-H4组ERK1/2磷酸化水平的降低均具有显著的统计学差异(p＜0.05，n=6)。同样，在离体SH-SY5Y细胞低氧模型中，持续性低氧刺激6和12h后，细胞内ERK1/2磷酸化水平也明显降低，并有显著的统计学差异(p＜0.05，n=6)。提示，ERK1/2磷酸化水平(活性)降低可能参与了早期脑I/HPC的形成过程。
(2)通过定量分析脑组织内ERK1/2蛋白表达量，我们发现，在早期脑低氧预适应的形成过程中，随着低氧暴露次数(H1-H4)的增加，小鼠海马和皮层组织内ERK1/2蛋白表达水平均无明显的改变；而在延迟性低氧预适应(H5和H6)发展过程中，小鼠皮层组织和海马内ERK1/2的蛋白表达水平显著降低。提示，ERK1/2蛋白表达量下调可能参与了晚期(延迟性)脑I/HPC的发展过程。
(3)抽提海马和皮层组织的核蛋白以检测ERK1/2的亚细胞分布情况，定量分析发现，随低氧次数的增加，海马组织核蛋白内ERK1/2的磷酸化水平降低，且在H3组有显著统计学差异；大脑皮层组织核蛋白内ERK1/2磷酸化水平也明显降低，并在H3和H4组有显著的统计学意义。同样，定量分析核外蛋白抽提物发现，随低氧次数增加，海马核外蛋白内ERK1/2的磷酸化水平降低，在H3组有显著的统计学差异；皮层核外蛋白内ERK1/2磷酸化水平也降低并有统计学差异。
(4)定量分析核蛋白抽提物内ERK1/2含量的变化情况发现，随着低氧次数的增加，海马组织内ERK1/2含量降低，并有统计学差异；而在皮层组织中，ERK1/2含量降低则不显著。
(5)同样，应用免疫组织化学方法发现，重复性低氧暴露后，小鼠大脑皮层内磷酸化ERK1/2(p-ERK1/2)的染色阳性细胞数明显降低。本实验从形态学上进一步证实了上述蛋白印迹结果，即ERK1/2的磷酸化水平在脑低氧预适应早期形成过程中明显降低。
总之，本项工作为国际上首次在整体I/HPC小鼠脑组织和持续性低氧刺激下的SH-SY5Y细胞内，对ERK1/2磷酸化水平和蛋白表达量的变化进行系统地探讨。我们在整体I/HPC小鼠模型上的研究表明，ERK1/2的活性(磷酸化水平)降低，以及ERK1/2蛋白表达量下调可能分别参与了脑早期低氧预适应和晚期延迟性低氧预适应的发生发展过程。同时，这一实验结果在离体培养的SH-SY5Y细胞上得到了进一步的验证。